РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ - Надшвидке заморожування та відтавання ембріонів корів з використанням мембраностабілізуючих речовин

Визначення оптимальної концентрації кріопротекторів при надшвидкому заморожуванні ембріонів. У результаті опрацювання ряду наукових робіт і проведених власних пошуків, нами було розроблено 4 вітрифікаційних середовища з різними концентраціями гліцерину, сахарози та культурального середовища з фетальною сироваткою. Вимиті мишачі ембріони були поділені на 4 групи відповідно до розроблених середовищ. У результаті проведених досліджень встановлено, що для кріоконсервування ембріонів найбільш оптимальним є вітрифікаційне середовище, в якому міститься 20,0 % гліцерину, 30,0 % сахарози і 50,0 % культурального середовища з 20,0 % фетальною сироваткою теляти. У цьому середовищі відзначено найвище виживання ембріонів після розморожування (65,0 %), та високий відсоток приживлення пересаджених ембріонів (38,4 %). Ембріони, які залишилися життєздатними після заморожування і відтавання, морфологічно були нормальними, круглої форми, без пошкодженої прозорої оболонки, перивітеліновий простір прозорий, бластомери чіткі.

Одержані результати та аналіз літературних даних про мембраностабілізуючі властивості різних модифікацій кріопротекторів послужили підгрунтям для проведення наступних експериментів з кріоконсервування ембріонів великої рогатої худоби вищевказаним методом. Для заморожування відбирали ембріони з морфологічною оцінкою відмінні та добрі, які за розвитком відповідали компактним морулам, раннім і пізнім бластоцистам (табл. 1).

Таблиця 1 Життєздатність і приживлення ембріонів корів залежно від різної концентрації кріопротекторів у вітрифікаційному середовищі при надшвидкому заморожуванні

Показники

Середовище

№1

№2

№3

№4

Вміст: гліцерину, %

20,0

25,0

35,0

25,0

сахарози, %

30,0

40,0

50,0

30,0

Культурального середовища з 20 % фетальною сироваткою, %

50,0

35,0

15,0

45,0

Кількість заморожених ембріонів, шт.

25

22

17

20

Життєздатність ембріонів після розморожування, шт.

13

17

9

8

Виживання, %

52,0

77,2

52,9

40,0

Пересаджено ембріонів, шт.

13

17

9

8

Кількість тільних реципієнтів, шт.

3

8

3

2

Приживлення ембріонів, %

23,1

47,0

33,3

25,0

Найвищий рівень виживання ембріонів (77,2 %) був у вітрифікаційному середовищі, до складу якого входило 25,0 % гліцерину, 40,0 % сахарози та 35,0 % середовища для культивування. З збільшенням концентрації гліцерину і кількості сахарози суттєво знижувалась життєздатність ембріонів та їх приживлення у реципієнтів. Вітрифікація ембріонів у середовищі з різними комбінаціями кріопротекторів гліцерину та сахарози вказує, що цим шляхом можна досягти задовільних результатів.

Морфофункціональні властивості деконсервованих ембріонів, заморожених надшвидким методом, на різних стадіях розвитку та їх якості. Метою цих досліджень було заморожування ембріонів надшвидким методом на різних стадіях морфологічного розвитку з метою визначення показників функціонального стану клітин після завершення циклу заморожування-відтавання. Встановлено, що високу життєздатність після деконсервування зберігали ембріони майже на всіх стадіях розвитку. Із 88 деконсервованих ембріонів 76,1 % мали високу морфологічну оцінку і лише 23,9 % були з ознаками дегенерації. Приживлення пересаджених ембріонів становило 47,7 %.

Мікроскопічне дослідження морфоструктури ембріонів показало, що кріопошкодження зустрічаються в окремих бластомерів, а вид пошкоджень залежить від стадії розвитку ембріона. Так, із 20 компактних морул - 16 (80,0 %) зберегли нормальну морфологічну структуру, їх приживлення після трансплантації було найвищим і становило 56,2 %. Аналогічні результати отримані при заморожуванні ранніх і пізніх бластоцист. Після розморожування із 17 ранніх бластоцист придатними до пересадки реципієнтам виявилось 14 (82,3 %), а з 21 розмороженої пізньої бластоцисти - 17 (80,9 %). При трансплантації ембріонів реципієнтам отримані задовільні результати їх приживлення: 57,1 % та 52,9 % відповідно.

У наших дослідженнях спостерігалась відмінність у життєздатності ембріонів після розморожування, які при морфологічній оцінці перед кріоконсервуванням були відмінної, доброї, та задовільної якості (табл. 2). Із 12 морул відмінної якості після розморожування не виявлено ембріонів незадовільної якості. Ембріони з пошкодженою прозорою оболонкою, порушенням зв'язку між бластомерами класифікували, як задовільні. Від загальної кількості розморожених морул цей показник становив 16,6 %. Відмінних та добрих морул було по 41,7 %. Морули з оцінкою добрі до кріоконсервування, після розморожування були оцінені таким чином: доброї якості - 40,0 %, задовільної - 33,3 % і незадовільної - 26,7 %. Найбільшу кількість незадовільних морул - 55,5 % було отримано при заморожуванні задовільних ембріонів відповідної стадії. Від морул відмінної якості одержано 80,0 % тільних реципієнтів, доброї - 54,5 % і задовільної лише 27,3 %. Аналогічні результати отримані при кріоконсервуванні бластоцист різної якості. Після розморожування 18 відмінних бластоцист 8 із них (44,4 %), були оцінені як ембріони відмінної якості, 38,9 % були доброї якості і 16,7 % задовільної. Бластоцисти з морфологічною оцінкою добрі також успішно перенесли процес кріоконсервування і після розморожування зберегли досить високий рівень життєздатності. Більша половина таких ембріонів - 54,5 % були доброї якості і лише 18,2 % оцінені, як незадовільні і мали значні дефекти прозорої оболонки, рихле з'єднання між бластомерами.

Таблиця 2 Вплив якості ембріонів до заморожування на їх життєздатність після розморожування та приживлення при трансплантації

Стадія розвитку та якість ембріонів до заморожування

N

Якість ембріонів після розморожування

Відмінна

Добра

Задовільна

Незадовільна

Морули, всього

36

З них: відмінні, n-%

12

5-41,7

5-41,7

2-16,6

добрі, n-%

15

-

6-40,0

5-33,3

4-26,7

задовільні, n-%

9

-

-

4-44,5

5-55,5

Трансплантовано, шт.

27

5

11

11

-

Тільних реципієнтів, гол.

13

4

6

3

-

Приживлення ембріонів, %

48,1

80,0

54,5

27,3

-

Бластоцисти, всього

52

З них: відмінні, n-%

18

8-44,4

7-38,9

3-16,7

-

добрі, n-%

22

-

12-54,5

6-27,2

4-18,2

задовільні, n-%

12

-

-

4-33,3

8-66,7

Трансплантовано, шт.

40

8

19

13

-

Тільних реципієнтів, гол.

19

6

10

3

-

Приживлення ембріонів, %

47,5

75,0

52,6

23,1

-

Встановлена тільність у 75,0 % реципієнтів після пересадки відмінних і відповідно 52,6 % і 23,1 % при використанні добрих і задовільних бластоцист.

Ембріони з морфологічною оцінкою задовільні недоцільно піддавати кріоконсервуванню, оскільки після розморожування більша половина з них були непридатними для пересадки. Такі ембріони економічно вигідно пересаджувати реципієнтам відразу після вимивання. У результаті дослідження встановлено, що найбільш оптимальними стадіями ембріонів для заморожування надшвидким методом є компактні морули, ранні та експандовані бластоцисти. Стадія розвитку ембріонів відіграє важливу роль у збереженні їх життєздатності під час заморожування і розморожування. Одержані нами результати підтверджують необхідність ретельної селекції ембріонів перед їх глибоким заморожуванням.

Використання мембраностабілізуючих речовин у середовищах при розморожуванні ембріонів та їх вплив на приживлення після трансплантації. Методичною особливістю цих досліджень було вивчення необхідності перебування ембріонів у середовищі, яке б сприяло відновленню можливих кріопошкоджень після впливу на них фізико-хімічних факторів, що виникають внаслідок глибокого заморожування. Для вияснення можливих шляхів адаптації ембріонів до надшвидкого охолодження, а також їх регенерації після розморожування, нами вивчався вплив препарату "Філомек", який є природною субстанцією із тканин морських організмів на основі фосфоліпідного комплексу. Головним компонентом препарату є фосфатидилхолін (70,0 % лецитину). Цей препарат розроблений лабораторією технології біопрепаратів Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України і який люб'язно був наданий нам для проведення досліджень.

Перш ніж проводити експерименти з вивчення впливу цього препарату на ембріони, проведені дослідження з вивчення його дії на якість деконсервованої сперми бугаїв-плідників. Препарат "Філомек", у концентраціях від 0,1 до 1,0 %, додавали до деконсервованої у 2,9 % розчині лимоннокислого натрію сперми бугаїв-плідників. Контролем слугувала сперма, розморожена в 2,9 % розчині лимоннокислого натрію. Результати досліджень показали, що препарат "Філомек" у концентрації 0,2 % позитивно впливає на якість деконсервованої сперми. Виживання в годинах і показник абсолютного виживання у досліді дорівнював 13,15 0,24; 33,90 0,97, а у контролі - 10,45 0,27; 27,07 0,68 відповідно. Різниця на користь досліду високо вірогідна (р 0,001).

Отримані результати стали основою для проведення відповідних експериментів із культивування ембріонів корів після розморожування. Було сформовано одну контрольну і три дослідні групи ембріонів, які окремо переносили у середовище для культивування, до якого було додано різні концентрації (0,1 %; 0,2 %; 0,3 %) препарату "Філомек". З метою розвитку регенераційних процесів у ембріонах у цих середовищах їх культивували при температурі 37 С протягом 36 годин. Найвищий відсоток виживання ембріонів (91,6 %) був у другій дослідній групі, де у середовище для культивування було введено препарат "Філомек" у 0,2 % концентрації. Додавання препарату у середовище привело до плавного повернення об'ємів бластомерів у їх вихідний стан та здатності ембріонів до подальшого розвитку. Наступним етапом наших досліджень було введення у середовище для короткотермінового культивування деконсервованих ембріонів (протягом 30-45 хвилин) 0,2 % концентрації препарату "Філомек" з подальшою трансплантацією ембріонів.

Ембріони контрольної групи, культивування яких проходило у середовищі без вищевказаного препарату, 78,5 % були доброякісними, а 21,5 % ембріонів мали часткове руйнування клітинної мембрани і були оцінені, як непридатні до пересадки. Рівень життєздатності та приживлення ембріонів дослідних груп був значно вищий і становив відповідно 90,9 % та 50,0 %, що на 13,6 відсотка більше, ніж у контрольній.

Такі результати дали нам підставу вважати, що фосфатидилхолін, який міститься у препараті "Філомек", не тільки бере участь у клітинному механізмі регенерації мембран при їх кріопошкодженні, але, очевидно відновлює фізіологічні властивості ембріонів, що сприяє процесам приживлення їх у статевих шляхах реципієнтів.

Підвищення кількісних та якісних показників ембріонів при введенні в організм корів-донорів вітаміну Е та комплексу фосфоліпідів. Результати проведених досліджень показали, що введення коровам-донорам дослідних груп вітаміну Е та комплексу фосфоліпідів із морських організмів (препарат "Філомек") позитивно вплинуло на поліовуляцію донорів та кількість і якість вимитих ембріонів (табл. 3).

Таблиця 3 Вплив препарату "Філомек" та вітаміну Е на якісні показники ембріонів

Показники

Групи ембріонів

Контрольна

Дослідні

І - вітамін Е

ІІ - препарат "Філомек"

ІІІ - вітамін Е + "Філомек"

Рівень поліовуляції на донора, шт.

7,66±0,82

9,14±1,08

8,71±0,92

9,37±0,85*

Вимитих ембріонів, всього:

28

36

36

47

З них доброякісних, n - %

17 - 60,8

23 - 63,9

21 - 61,8

34 - 72,3

дегенерованих, n - %

5 - 17,8

8 - 22,2

7 - 20,6

8 - 17,0

яйцеклітин, n - %

6 - 21,6

5 - 13,9

6 - 17,6

5 - 10,6

У тому числі на донора, шт.:

4,670,32

5,140,42

4,860,40

5,870,48*

З них доброякісних, шт.

2,830,25

3,280,30

3,000,26

4,250,40**

дегенерованих, шт.

0,830,09

1,140,12

1,000,13

1,000,08

яйцеклітин, шт.

1,000,11

0,710,08*

0,860,09

0,620,11*

Примітка. Тут і надалі: * - р0,05; ** - р0,01; *** - р0,001 - різниці вірогідності у порівнянні з контролем

Відносно високий рівень реакції яєчників у корів-донорів, особливо третьої дослідної групи, можна пояснити очевидно тим, що під впливом вітаміну Е та фосфоліпідного комплексу підвищується реактивність організму тварин на гонадотропіни. Якщо рівень полі овуляції у контрольних тварин становив 7,660,82 жовтих тіл на одного донора, то у тварин І, ІІ та ІІІ дослідних груп відповідно - 9,141,08; 8,710,92; 9,370,85. Це, у свою чергу, сприяло одержанню більшої кількості ембріонів від дослідних донорів.

Вихід ембріонів на одного донора у контрольній групі тварин становив 4,670,32, тоді як у І та ІІ дослідних групах він склав 5,140,42 та 4,860,40 відповідно, а у корів ІІІ групи 5,870,48. Комплексне введення дослідним тваринам вітаміну Е та фосфоліпідів позитивно вплинуло на вихід морфологічно якісних ембріонів. Найбільшу їх кількість було одержано від корів-донорів третьої дослідної групи - 72,3 %, що на 11,5 % більше у порівнянні з контролем. Вихід якісних ембріонів на одного донора у тварин контрольної групи становив 2,830,25; І дослідної групи - 3,280,30; ІІ і ІІІ групах - 3,000,26; 4,250,40 відповідно.

Слід відзначити, що збільшення кількісних та покращення якісних показників ембріопродуктивності було більш виражено у корів-донорів ІІІ дослідної групи, яким комплексно вводили вітамін Е та фосфоліпідний комплекс "Філомек". Основними показниками, які враховувались у подальших дослідженнях, були якість ембріонів до заморожування і після відтавання, збереженість і придатність їх до трансплантації та приживлення у реципієнтів. У результаті розморожування ембріонів встановлено, що рівень життєздатності ембріонів третьої дослідної групи був найвищий і становив 91,2%. У контролі цей показник становив 76,4 % і був нижчим на 6,2 %, 4,5 %, 14,8 % відповідно, ніж у дослідних групах. Приживлення ембріонів третьої групи становило 54,8 %, що на 16,4 % більше ніж у контролі.

Зміни, які виникають у репродуктивній системі корів-донорів при обробці гонадотропними препаратами, осіменінні та вимиванні ембріонів є технологічним стресом для тварин, який може супроводжуватися зростанням вмісту продуктів перекисного окиснення ліпідів у кров'яному руслі та зниженням активності антиоксидантних ферментів, що в свою чергу призводить до зниження вітаміну Е в організмі тварин. Одним із аспектів негативного впливу технологічного стресу на організм корів-донорів і, зокрема, на клітини крові, є інгібуюча дія вільних радикалів на ферментативну антиоксидантну систему.

Біохімічні дослідження крові корів-донорів першої, другої і третьої дослідних груп, показали, що показники антиоксидантного статусу були вірогідно вищими, ніж у крові контрольних тварин (табл. 4). Вміст гідроперекисів ліпідів у крові тварин контрольної групи був значно вищий, ніж у крові дослідних тварин. Введення в організм корів природного антиоксиданту вітаміну Е та фосфоліпідного препарату "Філомек" зменшує утворення продуктів перекисного окиснення ліпідів у крові у 1,7 рази, у порівнянні з контролем, та сприяє нормалізації обмінних процесів у репродуктивних органах тварин. Спільна антиокислювальна дія природного антиоксиданту і фосфоліпідів показала, що дія комплексу більш ефективна, ніж дія кожного із них окремо.

Таким чином, наше припущення щодо мембраностабілізуючої дії речовин та препаратів побічно підтверджено, оскільки зменшується перекисне окиснення ліпідів, яке сприяє порушенню мембран.

Таблиця 4 Активність ферментів антиоксидантного захисту та вміст продуктів перекисного окиснення ліпідів у крові корів-донорів, (М±m)

Показники

Групи корів-донорів

Контрольна n = 6

Дослідні

І - вітамін Е

ІІ - препарат "Філомек"

ІІІ - вітамін Е +"Філомек"

N = 7

N = 7

N = 8

Глутатіонпероксидаза, нМ GSH/хв./мг білка

21,2±2,32

26,6±1,2

32,1±1,03*

38,0±2,55**

Активність каталази, мМ/хв./мг білка

48,3±0,20

51,0±0,46**

52,0±0,13*

53,4±0,09*

Малоновий діальдегід, нМ/мл

6,4±0,22

5,9±0,13

4,9±0,08**

3,7±0,11***

Гідроперекисі ліпідів, Ех 1000

579,6±10,4

421,6±1,76*

425,3±13,53

341,3±21,53*

Очевидно, фосфоліпіди спільно з природним антиоксидантом утворюють єдину систему захисту ліпідів від окиснення та регулюють інтенсивність перекисного окиснення ліпідів при стресах у бік нормалізації, тим самим створюють такі умови у репродуктивній системі тварин, які сприяють збільшенню виходу доброякісних ембріонів, підвищують їх здатність до кріоконсервування та покращують приживлення у реципієнтів.

Вплив композиційних кріопротекторів поліфункціональної дії на збереження ембріонів корів при надшвидкому заморожуванні. Враховуючи важливе значення цілісності цитоплазматичних мембран для нормальної життєдіяльності ембріонів та з метою зниження негативного впливу на них фізико-хімічних факторів, що реалізуються на етапах кріоконсервування ембріонів при надшвидкому охолодженні, нами розроблено вітрифікаційне середовище з композиційними кріопротекторами поліфункціональної дії. У склад кріоконсервантів окрім гліцерину і сахарози, було додано препарат "Філомек" у концентрації 0,2 %.

Ембріони дослідної групи, які заморожувались у середовищі з додаванням препарату "Філомек", виявились більш стійкими до надшвидкого заморожування і після деконсервування нормально розвинених ембріонів було на 11,8 % більше, ніж у контролі. На нашу думку, це зумовлено швидшим включенням регенераційних процесів після розморожування, що сприяло нормалізації розвитку ембріонів. Рівень приживлення дослідних ембріонів у реципієнтів був значно вищий і становив 53,3 %, що більше на 14,9 %, ніж у контрольній групі. Це дає підставу стверджувати, що поряд із дією проникаючих і непроникаючих кріопротекторів, введення у кріоконсервант мембраностабілізуючих речовин має позитивний вплив на процес кріоконсервування ембріонів.

Введення препарату "Філомек" у склад кріоконсерванту для надшвидкого заморожування далеко не єдиний спосіб, який суттєво покращує підготовку ембріонів до прямого занурення у рідкий азот. Подальші дослідження були спрямовані для пошуку інших речовин і складників, які здатні збільшити в'язкість води при зниженні температури і зменшити ризик токсичного впливу високих концентрацій кріопротекторів на ембріони. Зокрема апробували у складі кріоконсерванта препарат холін-хлорид. Наявність метильних груп у молекулі цієї речовини обумовлює гідрофобний характер її взаємодії з біомакромолекулами, що сприяє реалізації кріозахисних властивостей холінів і підвищує ефективність традиційних кріопротекторів. Дози холін-хлориду підбиралися емпірично: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 мг на 1 мл середовища. Дані таблиці 5 свідчать, що введення холін-хлориду в середовище для заморожування в цілому покращило якість відтаяних ембріонів, у третій дослідній групі морфологічно придатних було 92,3 % проти 80,0 % у контрольній групі. У четвертій дослідній групі виживання деконсервованих ембріонів значно зменшилося, що, очевидно, пов'язано з великою дозою препарату. Високі результати приживлення були отримані при пересадці ембріонів реципієнтам усіх дослідних груп. У третій дослідній групі цей показник був на 8,3 % вищим від контролю.

Таблиця 5 Результативність надшвидкого заморожування ембріонів корів з використанням у вітрифікаційному середовищі холін-хлориду

Показники

Групи ембріонів

Контрольна

Дослідні

І - 0,1 % холін-хлориду

ІІ - 0,2 % холін-хлориду

ІІІ - 0,3 % холін-хлориду

ІV - 0,4 % холін-хлориду

Деконсервовано ембріонів, шт.

10

10

12

13

15

Життєздатних ембріонів, n - %

8-80,0

9-90,0

11-91,7

12-92,3

13-86,7

Пересаджено ембріонів, шт.

8

9

11

12

13

Тільних реципієнтів, n - %

4-50,0

5-55,5

6-54,5

7-58,3

7-53,8

Отже, додавання холін-хлориду у вітрифікаційне середовище підвищує стійкість ембріонів до надшвидкого заморожування, що призводить до покращення приживлення деконсервованих ембріонів у реципієнтів.

Порівняльне вивчення приживлення деконсервованих ембріонів, заморожених загальноприйнятим і надшвидким методами. Для порівняльного вивчення приживлення деконсервованих ембріонів проводили їх заморожування загальноприйнятим - програмним методом та надшвидким з використанням багатокомпонентного кріоконсерванта (табл. 6). Контрольна група ембріонів була заморожена програмним методом, а дослідні групи ембріонів - надшвидким методом у запропонованих вище вітрифікаційних середовищах з додаванням до них мембраностабілізуючих речовин.

Таблиця 6 Життєздатність і приживлення ембріонів при заморожуванні програмним та надшвидким методами

Показники

Метод кріоконсервування

Програмний

Надшвидкий

І - 25 % гліцерину, 40% сахарози

ІІ - + 0,2 % препарат "Філомек"

ІІІ - + 0,3 % препарат холін-хлорид

Розморожено ембріонів, шт.

13

10

12

11

Життєздатних ембріонів, шт.

11

8

11

10

Виживання ембріонів, %

84,6±10,7

80,0±9,8

91,6±9,3*

90,9±10,4

Пересаджено ембріонів, шт.

11

8

11

10

Тільних реципієнтів, гол.

6

4

6

6

Приживлення ембріонів, %

54,5±4,6

50,0±3,8

54,5±4,2

60,0±4,3**

Життєздатність деконсервованих ембріонів першої дослідної групи, які були заморожені надшвидким методом у вітрифікаційному середовищі без додавання мембраностабілізуючих речовин, була найнижчою і становила 80,0 % від кількості заморожених. При морфологічній оцінці ембріонів виявляли розірвані прозорі оболонки, стиснення бластомерів, їх некроз та включення у перивітеліновий простір. При застосуванні надшвидкого заморожування виживання ембріонів становило 80,0 - 91,6 %, а їх приживлення у реципієнтів 50,0 - 60,0 %.

Отже, отримані результати свідчать, що додавання до вітрифікаційного середовища, використаних у експериментах біологічно активних речовин, які мають мембраностабілізуючу дію, дає можливість підвищити результативність надшвидкого заморожування ембріонів.

Похожие статьи




РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ - Надшвидке заморожування та відтавання ембріонів корів з використанням мембраностабілізуючих речовин

Предыдущая | Следующая