Молекулярно-генетические методы исследования, Выделение ДНК из лейкоцитов венозной крови - Анализ ассоциаций tagSNPs и гаплотипов генов LEP и ACVR2A с развитием гестоза в популяциях русских и якутов

Выделение ДНК из лейкоцитов венозной крови

Выделение ДНК проводили стандартным методом с использованием фенол-хлороформной очистки [98, 120]. К 0.7 мл крови, стабилизированной ЭДТА (0,1 мл 0,5М раствора ЭДТА на 1 мл крови), в эппендорф добавляли 0,8 мл 1Ч SSC и сильно центрифугировали в течение 2 минут при 12000-13000 об/мин, после чего осторожно сливали супернатант. К осадку добавляли 1,4 мл 1Ч SSC и сильно встряхивали, чтобы разбить осадок, после чего снова центрифугировали при 12000-13000 об/мин. в течение 2 минут. После центрифугирования супернатант сливали и последнюю каплю снимали фильтровальной бумагой. К осадку добавляли 270 мкл 0,2М натрия ацетата (рН 7,0), тщательно и долго перемешивали, встряхивали до полной гомогенизации на протяжении 6-10 минут. К содержимому добавляли 30 мкл SDS, перемешивали и оставляли на 1 час в термостате при температуре 37°С, периодически перемешивая. Затем добавляли фенол-хлороформ (в соотношении 1:1) в равном объеме (примерно 300 мкл) и плавно перемешивали в течение 8-10 минут, после чего центрифугировали при 13000 об/мин 8 минут. После центрифугирования водную фазу (осторожно, не захватывая интерфазу) переносили в чистую пробирку эппендорф. К супернатанту в чистой пробирке эппендорф добавляли 1 мл 96% этилового спирта комнатной температуры, затем встряхивали для осаждения ДНК, после этого вращали пробирки для накручивания ДНК саму на себя. Затем центрифугировали в течение 2 минут при 12000 об/мин, чтобы комочек ДНК прилип ко дну пробирки, после чего осторожно сливали спирт. На следующем этапе добавляли 1 мл 70% этилового спирта, перемешивали, после чего центрифугировали при аналогичных условиях, затем спирт сливали. ДНК подсушивали на воздухе в течение 5-10 минут, добавляли 50 мкл деонизованной воды и оставляли на ночь для полного растворения ДНК. Выделенную ДНК замораживали и хранили при -20°С до проведения эксперимента

Похожие статьи




Молекулярно-генетические методы исследования, Выделение ДНК из лейкоцитов венозной крови - Анализ ассоциаций tagSNPs и гаплотипов генов LEP и ACVR2A с развитием гестоза в популяциях русских и якутов

Предыдущая | Следующая