ДНК-маркеры - Методы исследования популяции человека

Для изучения структуры генофонда и этногенеза современных популяций человека в качестве первых молекулярно-генетических маркеров стали использовать полиморфные аутосомные локусы ядерного генома. Их отличительной чертой является то, что они, отражая генетический вклад в формирование популяционной структуры обоих полов в равной степени, характеризуют человеческие сообщества в целом, дают более сбалансированную картину генетического разнообразия и более объективную оценку генетической структуры популяций. Аутосомные локусы ядерного генома позволяют достаточно точно дифференцировать крупные антропологические общности мира, включая кластеры внутри них.

Существует два основных типа полиморфизма ДНК аутосомных локусов: диаллельный, представленный однонуклеотидными заменами (SNP - single nucleotide polymorphism), а также инсерционно-делеционным полиморфизмом и полиаллельный, представленный гипервариабельными сателлитными повторами.

Особый интерес с популяционно-генетической точки зрения представляет исследование диаллельного полиморфизма SNP-локусов, ассоциированных с генами наследственных и наследственно обусловленных заболеваний. Анализ гаплотипов, сцепленных с мажорными мутациями в генах распространенных наследственных заболеваний, дает возможность идентифицировать изначальную хромосому, выяснить источник и природу ее происхождения, изучить миграции населения по дрейфу характерных для данной популяции мутаций. Сопоставляя спектры распределения однотипных мутаций в разных этнических группах можно определить степень генетической близости между ними и реконструировать их филогенетические взаимоотношения.

Гипервариабельные повторы представляют собой мультиаллельные системы с уровнем гетерозиготности, приближающимся к 100%, и подразделяются на минисателлиты (VNTR - variability number of tandem repeats), включающие 11-60 нуклеотидов в "коровых" звеньях с числом повторов от двух до нескольких сотен, и микросателлиты (STR - short tandem repeats), включающие 2-6 нуклеотидов в "коровых" звеньях с числом повторов от десяти до ста. Гипервариабельные полиморфные локусы обладают рядом свойств, делающих их удобными и высокоинформативными маркерами для решения вопросов популяционной и эволюционной генетики. К ним относятся: широкое распространение в геноме; простота генотипирования; высокая скорость спонтанного мутирования (10-2 - 10-4 на локус за поколение) локализация преимущественно в не кодирующих областях и, следовательно, селективная нейтральность (за исключением случая тесного сцепления с адаптивно значимыми генами).

Для анализа ДНК-маркеров кровь из вены набирают в количестве 4-8 мл в пробирки Vacuette с консервантом 0,5М ЭДТА (рН 8,0). Образцы ДНК выделяют из цельной крови стандартным методом ферментативного гидролиза с протеиназой К и последующей фенольно-хлороформной экстракцией.

Анализ полиморфных локусов проводят методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК с использованием ДНК-полимеразы Termus aquaticus. Для анализа результатов амплификации, полученные амплификаты, разделяют электрофоретически в полиакриламидном геле. В качестве маркера размеров аллелей использовали ДНК фага.

При изучении генетической структуры населения в регионе проводят исследование следующих локусов ДНК-маркеров: IVS6aGATT(CFTR) (тетрануклеотидные тандемные повторы 6а интрона гена CFTR), KM.19/PstI (диаллельный полиморфизм локуса D7S23, фланкирующего ген CFTR), HUMTHOI (тетрануклеотидные AATG повторы в 1 интроне гена TH), HUMFABP (тринуклеотидные тандемные повторы ATT во 2 интроне гена FABP). Последовательности использованных праймеров приведены в табл. 2.

Локус IVS6aGATT (CFTR)

Ген муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) расположен на длинном плече хромосомы 7 в регионе 7q31. В гене CFTR существует ряд повторяющихся последовательностей, к которым относится тандемные тетрануклеотидные GATT повторы микросателлитного локуса IVS6aGATT в 6а интроне. На данный момент известно пять аллелей, имеющих четыре, пять, шесть, семь или восемь повторов GATT (номенклатура аллелей строится соответственно количеству повторов). При амплификации изучаемого участка 6а интрона гена CFTR происходит синтез фрагментов ДНК различающихся длиной на 4 п. н. в зависимости от того, с какого аллеля идет амплификация. Фрагменты ДНК такой длины легко можно разделить при гель-электрофорезе и, следовательно, различить аллели и генотипы исследуемых образцов.

Таблица 2. Последовательности праймеров, использованных для амплификации

Название локуса

Последовательности праймеров

KM.19/PstI
    5' - GCTGCATCATATAAGTTGCC - 3' 5' - AACGCTACACTGTTAATTTT - 3'

IVS6aGATT (CFTR)
    5' - CAAGTCTTTCAGTGATCTTC - 3' 5' - TGAGCAGTTCTTAATAGATAA - 3'

HUMTHOI
    5'- GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT 5'-ATTCAAAGGGTATCTGGGCTCTGG

HUMFABP
    5' - GTAGTATCAGTTTCATAGGGTCACC 5' - CAGTTCGTTTCCATTGTCTGTCCG

Наиболее частыми являются аллели 7 и 6. Причем в популяциях Евразии преобладает аллель 7 с частотой до 0,75-0,85 в Европе, а в популяциях коренного населения Нового Света преобладает аллель 6 с концентрацией до 0,77. Аллели 4 и 5 встречаются крайне редко с пропорцией 0,005, а аллель 8 в европейских популяциях также выявляется нечасто. Тем не менее, в популяциях волго-уральского региона, включая чувашей, марийцев, удмуртов, его частота достигает полиморфных величин, варьируя от 0,05 до 0,1. В этих популяциях данный полиморфизм целесообразно использовать в качестве эффективного генетического ДНК - маркера при проведении популяционно-генетических исследований.

Локус D7S23(KM.19)

Локус D7S23 фланкирует 5'-конец гена CFTR и характеризуется наличием полиморфных сайтов рестрикции для рестриктаз Hin6I (участок CS.7) и PstI (участок KM.19). Полиморфизм КМ.19 характеризуется наличием двух аллелей: аллель 1 - отсутствие сайта рестрикции для эндонуклеазы PstI, аллель 2 - наличие сайта рестрикции. В результате рестрикции эндонуклеазой PstI амплифицированного фрагмента ДНК в случае аллеля 2 образуется два фрагмента длиной 600 и 400 п. н., в случае аллеля 1 рестрикции не происходит и наблюдается один фрагмент длиной 1000 п. н. В большинстве популяций мира преобладающим по частоте встречаемости является аллель 1.

Локус HUMTHOI

Ген тирозингидроксилазы человека (TH) Локализован на коротком плече 11 хромосомы (11p15.5) обнаружил наличие короткого тандемного повтора с коровой последовательностью AATG в 1 интроне, этот полиморфизм гена тирозингидроксилазы обозначается HUMTH0I. В данном локусе обнаруживается аллельное разнообразие. Когда из тетрануклеотидной последовательности элиминируется 1 нуклеотид, такие аллели обозначаются как n,3, где n число коровых повторов (9,3). Данный полиморфный локус имеет высокий уровень гетерозиготности, достигая 70-80%-го уровня, в связи с этим он нашел широкое применение при идентификации личности.

Локус HUMFABP2

Ген белка, связывающего жирные кислоты в слизистой кишечника, FABP2, локализован на коротком плече хромосомы 4. Микросателлитный локус, локализованный во втором интроне этого гена, представляет собой тринуклеотидный повтор АТТ, и обозначается как HUMFABP2. Номенклатура аллелей соответствует числу повторов коровой тринуклеотидной последовательности. В литературе описано восемь аллелей этого локуса с числом повторяющихся коровых единиц от 8 до 15. Изучение данного полиморфного маркера не обнаружило никаких ассоциаций с какими-либо заболеваниями. Исходя из довольно высокого значения гетерозиготности в популяциях Европы (Н?0,6), становится очевидной целесообразность использования этого маркера в популяционно-генетических исследованиях.

Похожие статьи




ДНК-маркеры - Методы исследования популяции человека

Предыдущая | Следующая