Методы исследования функциональной активности лейкоцитов - Патофизиологическая роль церулоплазмина при лейкоцитозах и лейкопениях
Адгезивную способность лейкоцитов изучали по их способности прилипать к эндотелию сосудистой стенки по разработанной оригинальной методике.
У крысы под эфирным наркозом производили срединную тораколапаротомию. Выделяли аорту. Через начальный отдел аорты устанавливали полиэтиленовый катетер, на него накладывали две фиксирующие лигатуры. Через катетер осуществляли забор крови, в качестве антикоагулянта использовали гепарин (50 - 75 ЕД/мл). На уровне начального отдела брюшной аорты устанавливали второй катетер и фиксировали его лигатурой. Функционально активный участок эндотелия аорты имел площадь 75 мм2. Ветви аорты подвергали электрокоагуляции. Проксимальный катетер соединяли с полиэтиленовым резервуаром, в котором находилась цельная гепаринизированная кровь в количестве 1 мл. Движение крови осуществлялось благодаря давлению воздуха в резервуаре, которое создавалось компрессором. Причем, создаваемое таким образом давление крови было близко по значениям к физиологическому и составляло 100+10 мм. рт. ст. Во время манипуляции сосуд орошался теплым физиологическим раствором. Прошедшую через участок сосуда кровь собирали в пластиковую пробирку для микропроб. Продолжительность всей манипуляции составляла 10 - 12 минут. Подсчитывали общее количество лейкоцитов и лейкоформулу до и после адгезии и вычисляли % адгезии лейкоцитов и их популяций
Необходимо отметить, что в настоящее время не существует стандартизированных методов оценки адгезии лейкоцитов. Известные модификации принципиально отличаются по объекту, к которому происходит адгезия: нейлоновое волокно, стекло и др (50, 56). Разработанный нами метод оценки адгезивной способности лейкоцитов является наиболее приближенным к физиологическим условиям: в качестве объекта адгезии выбрана эндотелиальная стенка, давление потока крови было постоянным и приближалось по своим значениям к физиологическому.
Фагоцитарную способность лейкоцитов оценивали по способности поглощать частицы монодисперсного (Ш 1,7 мкм) полистирольного латекса (180).
В ячейку иммунологического планшета помещали 0,1 мл цельной гепаринизированной крови и добавляли 0,1 мл взвеси стандартных частиц латекса в концентрации 108 частиц/мл, инкубировали в термостате при 370С 30 минут. Приготовленные мазки фиксировали метанолом, окрашивали азур II-эозином по методу Романовского-Гимза. Под иммерсионной микроскопией после подсчета 200 клеток учитывали активность фагоцитоза - число фагоцитов, содержащих частицы латекса в цитоплазме (% клеток) и интенсивность фагоцитоза - число частиц латекса в подсчитанных клетках в пересчете на 1 клетку (у. е./клетку).
Цитохимическими методами определяли внутриклеточное содержание миелопероксидазы и катионных белков в гранулоцитах.
Миелопероксидазу определяли по методу Грехема-Кнолля (100, 186).
Мазки крови, фиксированные в парах спирта-формалина, заливали на 5 минут реактивом следующего состава:
6 мл 96% спирта,
Бензидин на кончике ножа,
- 4 мл дистиллированной воды, 0,02 мл 3% раствора Н2О2.
Затем промывали в проточной воде 2 минуты и докрашивали азур II - эозином по методу Романовского - Гимза. Под иммерсионной микроскопией учитывали пероксидазопозитивные клетки (содержащие гранулы от светло - желтого до темно - коричневого цвета), которые делили на 4 группы:
- 0 - отсутствие гранул в цитоплазме, 1 - 1/3 площади цитоплазмы заполнена гранулами, 2 - до 2/3 цитоплазмы заполнено гранулами, 3 - вся цитоплазма заполнена гранулами.
Всего подсчитывали 100 нейтрофилов. Результат выражали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК):
0А+1В+2С+3Д
СЦК = , у. е.,
100
Где А, В, С, Д - число клеток соответственно 0, 1, 2, 3 групп.
Катионные белки гранулоцитов определяли по методу Пигаревского (121 - 123 ).
Высушенные на воздухе мазки крови погружали на 15-20 мин. в забуференный спиртовой раствор прочного зеленого с рН 8,15. Затем препараты ополаскивали в двух сменах дистиллированной воды. Ядра докрашивали 0,1% раствором сафранина.
Спиртовой раствор красителя готовили на метаноловом буфере трис-соляная кислота с конечной величиной рН 8,1 - 8,2. Для этого 0,8г сухого порошка три(оксиметил) - аминометана (НПО "Биохимреактив") растворяли в 50 мл метилового спирта и к полученному раствору добавляли 47,3 мл дистиллированной воды и 2,75 мл 1н. соляной кислоты, которую готовили из фиксанала. В приготовленном метаноловом трис-буфере растворяли 0,1г сухого красителя прочного зеленого (Colour index 42053). Получали 0,1%-ный раствор прочного зеленого в 50%-ном метиловом спирте, забуференном до рН 8,1 - 8,2.
Под иммерсионной микроскопией учитывали клетки с гранулами, окрашенными в различные оттенки зеленого цвета, которые делили на 4 группы:
- 0 - отсутствие окраски цитоплазмы или ее слабое окрашивание до 2/3 площади цитоплазмы, или средней интенсивности окраска до 1/3 площади; 1 - слабо окрашена (бледно-зеленые гранулы) вся цитоплазма или средняя интенсивность окраски (светло-зеленые гранулы) до 2/3 площади цитоплазмы, или сильная окраска до 1/3 площади (темно-зеленые гранулы); 2 - вся цитоплазма заполнена гранулами средней интенсивности окраски или сильная окраска до 2/3 цитоплазмы; 3 - вся цитоплазма заполнена темно-зелеными гранулами.
После подсчета 100 клеток определяли СЦК (у. е.) по описанной выше формуле.
О генерации АФК фагоцитами судили по интенсивности хемилюминесценции цельной крови, усиленной люминолом (60, 176).
Регистрацию ХЛ осуществляли аппаратом "Хемилюминомер-003" с компьютерным обеспечением и выводом хемилюминограмм на принтер. ХЛ цельной крови изучали по методу (176). К 2 мл забуференного физиологического раствора (20мМ КН2РО4, 105 мМ КСl на 1л дистиллированной воды, рН 7,5 ед.) с растворенным в нем люминолом (0,1 х 10-5 М) добавляли 0,1 мл крови. Кювету помещали в камеру прибора, где поддерживалась постоянная температура 370С и регистрировали запись в течение 10 минут. Затем пробу инкубировали 60 минут при 370С в стеклянном стаканчике, к стеклянной поверхности которого происходила адгезия лейкоцитов и активация внутриклеточного метаболизма. Таким образом изучали спонтанную и индуцированную светимость лейкоцитов. Запись свечения осуществляли также в течение 10 минут.
Подсчитывали светосумму свечения (СС, у. е. х мин) и максимальную светимость (МС, у. е.). Полученные результаты выражали в единицах (у. е.) по отношению к эталону свечения, суммарный световой поток которого составлял 5,2х105 квант/с. Об активности отдельной клетки судили, пересчитывая результаты на 105 гранулоцитов в исследуемой пробе.
Похожие статьи
-
Эксперименты выполнены на 350 белых беспородных крысах и крови 100 здоровых людей - доноров областной станции переливания крови. Все исследования на...
-
На первом этапе эксперимента к цельной крови добавляли растворы Цп различных концентраций (мкг/мл): 100,0; 200,0; 300,0; 400,0; 600,0; что...
-
Одним из представителей РОФ третьего эшелона является Цп - исключительно активный гликопротеин 2 - глобулиновой фракции сыворотки крови человека и высших...
-
Фагоциты как центральное звено неспецифической защиты организма На современном этапе развития медицинской науки иммунофагоцитарная система...
-
При лейкоцитозе в ответ на введение пирогенала нами отмечено изменение функциональной активности лейкоцитов. В контрольной группе, по данным ХЛ -...
-
Влияние церулоплазмина на количественный состав лейкоцитов при "невоспалительных" лейкоцитозах На предыдущем этапе работы было показано, что Цп способен...
-
Первой группе интактных животных Цп вводили внутрибрюшинно однократно в дозе 30 мг/кг. 30 мг/кг - доза, составляющая 75% от физиологической концентрации...
-
Для изучения влияния Цп на процессы генерации АФК фагоцитами в условиях in vitro использовали цельную кровь здоровых людей - доноров крови, так как...
-
Лейкоцитозы и лейкопении - Патофизиологическая роль церулоплазмина при лейкоцитозах и лейкопениях
Реализация неспецифической защиты организма зависит не только от функциональной активности фагоцитирующих клеток, но и от их количественного...
-
Влияние церулоплазмина на количественный состав и фагоцитарную функцию лейкоцитов при асептическом воспалении Воспалительные процессы различной этиологии...
-
Введение - Патофизиологическая роль церулоплазмина при лейкоцитозах и лейкопениях
Актуальность исследования. Регуляция количественного состава и функциональной активности фагоцитирующих клеток является актуальной проблемой современной...
-
Определение активности церулоплазмина. Активность Цп определяли по методу Тэна Э. В. (175). В пробирку вносили 0,1 мл сыворотки крови, 1 мл 0,4М...
-
РОФ - функционально разнородная группа белков, способных быстро изменять свою концентрацию при различных нарушениях гомеостаза независимо от природы и...
-
Выражаю благодарность научному руководителю доктору медицинских наук, профессору Людмиле Владимировне Кривохижиной за помощь в планировании и организации...
-
На следующем этапе исследования у нас возник вопрос о возможности влияния Цп на изменение функциональной активности лейкоцитов при воспалении на...
-
Реализация функциональной активности фагоцитирующих клеток находится, в том числе, под контролем различных отделов нервной системы и регуляторных...
-
1.1 не нарушена (норма) 1.2 нарушена (дисфункция) по типу: 1.2.1 синусовой брадикардии (ЧСС днем 1.2.2 синдрома Шорта (тахикардии-брадикардии) 1.2.3...
-
Понятие "метод" (от греч. "методос" -- путь к чему-либо) означает совокупность приемов и операций практического и теоретического освоения...
-
Основаны на регистрации электропотенциалов или звуковых явлений, возникающих в работающем органе. Электрокардиография (ЭКГ) - Метод, основанный на...
-
Преходящая форма фибрилляции предсердий с указанием циркадной активности: 4.1.1 в дневные часы (чч. мм.) 4.1.2 в ночные часы (чч. мм.) 4.1.3 без...
-
Б. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТКИ - Основные положения учения о клетке
1) Методы исследования структурной организации клетки. Световая микроскопия. * Получение четких изображений мелких (недоступных человеческому глазу)...
-
Кора больших полушарий. Современные методы исследования функций мозга - Предмет и задачи физиологии
"Мозг - это последняя из тайн природы, Которая когда-либо откроется человеку." Англ. физиолог Чарлз Скотт Шеррингтон. "Асимметрия является основным...
-
Район исследования и его физико-географическая характеристика Тамбовская область расположена в центре Европейской части России, в средних широтах...
-
Микроскопический метод исследования предусматривает наблюдение за живыми и убитыми микробами в окрашенном и неокрашенном состоянии. Различают простые и...
-
Система методов технических медицинских исследований - Научные основы приборостроение в медицине
Инструментальные средства медико-биологических исследований представляют собой совокупность приборов, аппаратов, систем, комплексов и приспособлений к...
-
Роль трансформации при литической инфекции - Строгие постулаты Коха
Согласно общепринятым взглядам, способность вируса вызывать заболевание - это всего лишь побочный эффект работы механизмов, лежащих в основе размножения...
-
Международный терроризм - в политическом аспекте - совершение, организация, содействие осуществлению, финансирование или поощрение агентами или...
-
Понятие "стресс-теста" в кардиологии включает в себя оценку функционального резерва и состояния сердечно-сосудистой системы при выполнении различных...
-
Методы, используемые в исследовании: Анкетирование - метод получения психологической информации, а также социологических и демографических данных -...
-
6.1 манифестная форма (на ЭКГ признаки предвозбуждения желудочков в виде дельта-волны) 6.2 преходящая форма (эпизоды ЭКГ, на которых регистрируются...
-
Изменение Границ Сердца При Гипертрофии Правого И Левого Желудочков, Общем Увеличении Сердца, Гидроперикарде. Диагностическое Значение. Относительная...
-
Методы и организация исследования Анализ литературных источников проводился на всех этапах исследования. Анализ специальной научно-методической...
-
Физические методы исследования - Основные методы обследования больного при различных заболеваниях
Ознакомившись с жалобами больного, историей развития болезни, социально-бытовыми условиями и особенностями семейного анамнеза, приступают к объективному...
-
Обмен белков - Роль белков в организме
Аминокислоты, образовавшиеся после расщепления белков в пищеварительном тракте, всасываются в кровь. В кровь всасывается также незначительное количество...
-
Простой метод окраски, Сложные методы окраски - Изучение морфологии микроорганизмов
Препарат помещают на подставку для окраски, исследуемым материалом вверх. Пипеткой наносят на него раствор красителя. По истечении указанного времени...
-
Ветспециалистам, осуществляющим отбор проб для исследования в ветлабораторию, необходимо знать, что патологический материал от павшего и вынужденно...
-
Основные методы, которые были использованы при исследовании видов рода Amanita Fr. - это среднемасштабный маршрутный метод исследования микобиоты и...
-
В многоклеточном организме все сложные проявления жизни возникают в результате координированной активности составляющих его клеток. Задача цитолога -...
-
Метод исследования в свете люминесценции - Методы изучения клетки
Метод Исследования в свете люминесценции состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их...
-
Методы биологических исследований - Аналогия и моделирование в биологических исследованиях
Когда мы говорим о биологии, мы говорим о науке, которая занимается исследованием всего живого. Все живые существа, включая ареал их обитания, изучаются....
Методы исследования функциональной активности лейкоцитов - Патофизиологическая роль церулоплазмина при лейкоцитозах и лейкопениях