Методы исследования функциональной активности лейкоцитов - Патофизиологическая роль церулоплазмина при лейкоцитозах и лейкопениях

Адгезивную способность лейкоцитов изучали по их способности прилипать к эндотелию сосудистой стенки по разработанной оригинальной методике.

У крысы под эфирным наркозом производили срединную тораколапаротомию. Выделяли аорту. Через начальный отдел аорты устанавливали полиэтиленовый катетер, на него накладывали две фиксирующие лигатуры. Через катетер осуществляли забор крови, в качестве антикоагулянта использовали гепарин (50 - 75 ЕД/мл). На уровне начального отдела брюшной аорты устанавливали второй катетер и фиксировали его лигатурой. Функционально активный участок эндотелия аорты имел площадь 75 мм2. Ветви аорты подвергали электрокоагуляции. Проксимальный катетер соединяли с полиэтиленовым резервуаром, в котором находилась цельная гепаринизированная кровь в количестве 1 мл. Движение крови осуществлялось благодаря давлению воздуха в резервуаре, которое создавалось компрессором. Причем, создаваемое таким образом давление крови было близко по значениям к физиологическому и составляло 100+10 мм. рт. ст. Во время манипуляции сосуд орошался теплым физиологическим раствором. Прошедшую через участок сосуда кровь собирали в пластиковую пробирку для микропроб. Продолжительность всей манипуляции составляла 10 - 12 минут. Подсчитывали общее количество лейкоцитов и лейкоформулу до и после адгезии и вычисляли % адгезии лейкоцитов и их популяций

Необходимо отметить, что в настоящее время не существует стандартизированных методов оценки адгезии лейкоцитов. Известные модификации принципиально отличаются по объекту, к которому происходит адгезия: нейлоновое волокно, стекло и др (50, 56). Разработанный нами метод оценки адгезивной способности лейкоцитов является наиболее приближенным к физиологическим условиям: в качестве объекта адгезии выбрана эндотелиальная стенка, давление потока крови было постоянным и приближалось по своим значениям к физиологическому.

Фагоцитарную способность лейкоцитов оценивали по способности поглощать частицы монодисперсного (Ш 1,7 мкм) полистирольного латекса (180).

В ячейку иммунологического планшета помещали 0,1 мл цельной гепаринизированной крови и добавляли 0,1 мл взвеси стандартных частиц латекса в концентрации 108 частиц/мл, инкубировали в термостате при 370С 30 минут. Приготовленные мазки фиксировали метанолом, окрашивали азур II-эозином по методу Романовского-Гимза. Под иммерсионной микроскопией после подсчета 200 клеток учитывали активность фагоцитоза - число фагоцитов, содержащих частицы латекса в цитоплазме (% клеток) и интенсивность фагоцитоза - число частиц латекса в подсчитанных клетках в пересчете на 1 клетку (у. е./клетку).

Цитохимическими методами определяли внутриклеточное содержание миелопероксидазы и катионных белков в гранулоцитах.

Миелопероксидазу определяли по методу Грехема-Кнолля (100, 186).

Мазки крови, фиксированные в парах спирта-формалина, заливали на 5 минут реактивом следующего состава:

6 мл 96% спирта,

Бензидин на кончике ножа,

    4 мл дистиллированной воды, 0,02 мл 3% раствора Н2О2.

Затем промывали в проточной воде 2 минуты и докрашивали азур II - эозином по методу Романовского - Гимза. Под иммерсионной микроскопией учитывали пероксидазопозитивные клетки (содержащие гранулы от светло - желтого до темно - коричневого цвета), которые делили на 4 группы:

    0 - отсутствие гранул в цитоплазме, 1 - 1/3 площади цитоплазмы заполнена гранулами, 2 - до 2/3 цитоплазмы заполнено гранулами, 3 - вся цитоплазма заполнена гранулами.

Всего подсчитывали 100 нейтрофилов. Результат выражали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК):

0А+1В+2С+3Д

СЦК = , у. е.,

100

Где А, В, С, Д - число клеток соответственно 0, 1, 2, 3 групп.

Катионные белки гранулоцитов определяли по методу Пигаревского (121 - 123 ).

Высушенные на воздухе мазки крови погружали на 15-20 мин. в забуференный спиртовой раствор прочного зеленого с рН 8,15. Затем препараты ополаскивали в двух сменах дистиллированной воды. Ядра докрашивали 0,1% раствором сафранина.

Спиртовой раствор красителя готовили на метаноловом буфере трис-соляная кислота с конечной величиной рН 8,1 - 8,2. Для этого 0,8г сухого порошка три(оксиметил) - аминометана (НПО "Биохимреактив") растворяли в 50 мл метилового спирта и к полученному раствору добавляли 47,3 мл дистиллированной воды и 2,75 мл 1н. соляной кислоты, которую готовили из фиксанала. В приготовленном метаноловом трис-буфере растворяли 0,1г сухого красителя прочного зеленого (Colour index 42053). Получали 0,1%-ный раствор прочного зеленого в 50%-ном метиловом спирте, забуференном до рН 8,1 - 8,2.

Под иммерсионной микроскопией учитывали клетки с гранулами, окрашенными в различные оттенки зеленого цвета, которые делили на 4 группы:

    0 - отсутствие окраски цитоплазмы или ее слабое окрашивание до 2/3 площади цитоплазмы, или средней интенсивности окраска до 1/3 площади; 1 - слабо окрашена (бледно-зеленые гранулы) вся цитоплазма или средняя интенсивность окраски (светло-зеленые гранулы) до 2/3 площади цитоплазмы, или сильная окраска до 1/3 площади (темно-зеленые гранулы); 2 - вся цитоплазма заполнена гранулами средней интенсивности окраски или сильная окраска до 2/3 цитоплазмы; 3 - вся цитоплазма заполнена темно-зелеными гранулами.

После подсчета 100 клеток определяли СЦК (у. е.) по описанной выше формуле.

О генерации АФК фагоцитами судили по интенсивности хемилюминесценции цельной крови, усиленной люминолом (60, 176).

Регистрацию ХЛ осуществляли аппаратом "Хемилюминомер-003" с компьютерным обеспечением и выводом хемилюминограмм на принтер. ХЛ цельной крови изучали по методу (176). К 2 мл забуференного физиологического раствора (20мМ КН2РО4, 105 мМ КСl на 1л дистиллированной воды, рН 7,5 ед.) с растворенным в нем люминолом (0,1 х 10-5 М) добавляли 0,1 мл крови. Кювету помещали в камеру прибора, где поддерживалась постоянная температура 370С и регистрировали запись в течение 10 минут. Затем пробу инкубировали 60 минут при 370С в стеклянном стаканчике, к стеклянной поверхности которого происходила адгезия лейкоцитов и активация внутриклеточного метаболизма. Таким образом изучали спонтанную и индуцированную светимость лейкоцитов. Запись свечения осуществляли также в течение 10 минут.

Подсчитывали светосумму свечения (СС, у. е. х мин) и максимальную светимость (МС, у. е.). Полученные результаты выражали в единицах (у. е.) по отношению к эталону свечения, суммарный световой поток которого составлял 5,2х105 квант/с. Об активности отдельной клетки судили, пересчитывая результаты на 105 гранулоцитов в исследуемой пробе.

Похожие статьи




Методы исследования функциональной активности лейкоцитов - Патофизиологическая роль церулоплазмина при лейкоцитозах и лейкопениях

Предыдущая | Следующая