Этапы проведения бактериологического исследования - Ассоциативные болезни птиц

1 день-

Вскрытие трупов, посевы из внутренних органов на МПБ и МПА

2 день -

При росте типичных для эшерихий колоний, снятие 2-3 характерных колоний и пересев их на среды Эндо или Левина - 2 чашки на каждую колонию.

3 день-

Приготовление мазков, окраска, микроскопия их. Посев на пестрый ряд и бульон Хоттингера. Приготовление суспензии культуры и заражение белых мышей и цыплят. Приготовление антигена для серологической типизациипо О-антигену.

4 день-

Предварительный учет биохимических свойств культур, серологическая типизация (капельная и развернутая РА). Определение чувствительности культур к антибиотикам.

5 день -

Учет РА (предварительный). Окончательный учет биохимических свойств. Учет чувствительности к антибиотикам.

6-7 день-

Окончательный учет РА. Завершение учета биохимических свойств культуры. Учет биологической пробы.

1. Глицериновый раствор для консервирования органов и тканей.

Глицерин - 250 мл.

Хлористый натрий - 5 г.

Дистиллированная вода - 750 мл.

Раствор стерилизуют в автоклаве при 1 атм. (1200С) 20 минут или кипятят в течении 30 минут.

    2. Для изучения ферментативной активности культур можно использовать 0,3% полужидкий агар с углеводами и индикатором Андрадэ. На той же среде, но без углеводов и индикатора, определяют подвижность. Посев проводят с МПА уколом в столбик среды. подвижные штаммы растут по всему столбику среды с ее помутнением, а не подвижные - только по уколу, среда остается прозрачной. 3. Реакция с метилротом. Для проведения реакции готовят среду Кларка, в состав которой входят: пептон - 5г. двуосновной фосфорнокислый калий (К2НРО4) -5г. дистиллированная вода - 100 мл.

Смесь подогревают, периодически помешивая ее для быстрейшего растворения компонентов, затем холаждают и фильтруют через бумажный фильтр, рН не устанавливают. Среду разливают в пробирки по 5 мл. и стерилизуют при 0,5 атм. (1100С) 15 минут или текучим паром (дробно) ежедневно по 20 минут в течении 3-х дней.

Приготовление раствора индикатора: 0,01 г. метилрота растворяют в 30 мл 960 спирта-ректификата, после чего добавляют 20 мл. дистиллированной воды. Раствор сохраняется долго в темном месте.

Техника проведения реакции: в пробирку 2-х суточной культурой изучаемых бактерий в среде Кларка добавляют 5 капель индикатора метилрота и встряхивают пробирку.

Учет реакции проводится сразу после добавления индикатора. В зависимости от величины рН, цвет культуры изменяетсярозовое окрашивание (рН ниже 5,0) положительная реакция (+), желтое окрашивание (рН выше 5,0) - отрицательная реакция (-). Желтовато-оранжевый цвет культуры указывает на сомнительную реакцию (+).

4. Реакция Фогес-Проскауэра (на образование ацетилметилкарбинола из глюкозы).

К 1 мл 2-суточной культуры бактерий в среде Кларка добавляют 0,2 мл 40%-ного водного раствора едкого калия (КОН) и 0,5 мл 6%-ного спиртового раствора альфа-нафтола. Через 3-5 минут проводят учет реакции. При наличии в культуре ацетилметилкарбинола появляется розовое окрашивание (положительная реакция), при отрицательной реакции культура окрашивается в желтый цвет. Окраска культуры в желтовато-оранжевый цвет свидетельствует о сомнительной реакции.

5. Определение способности бактерий усваивать цитратные и аммонийные соли.

Определение указанных свойств бактерий проводят на среде:

    А) Козера, в состав которой входят - кислый фосфорнокислый натрий аммоний ( NaNH4 HPO4 . 4H2O) -1,5г. однозамещенный фосфорнокислый калий (КН2РО4)-1г., сернокислый магний(МоО47Н2О) - 0,2г., лимоннокислый натрий (Na3C6H5O7 . 2H2O)- 3г., дистиллированная вода - 100 мл. Смесь фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки и стерилизуют при 1200 15-20 минут. Готовая среда бесцветная. Засеянные изучаемым микроорганизмом пробирки, инкубируют при 370С в течение 2-4 суток. Бактерии, усваивающие цитратные и аммонийные соли, хорошо растут, вызывая помутнение среды. Отсутствие роста бактерий в среде Козера, указывает на неспособность усвоения цитратных и аммонийных солей (среда остается прозрачной). Б) на среде Симмонса - дистиллированная вода - 1000 мл., двузамещенный фосфорнокислый аммоний - (NH4HPO4) -1,5 г., однозамещенный фосфорный калий - КН2РО4 - 1г. сернокислый магний - MgSO4 . 7H2O -0,2г., трехзамещенный лимоннокислый натрий -0,2 г., агар - 20,0г. устанавливаемый рН - 7,2 (добавляя 10%-ный раствор NaOH и затем добавляют 10 мл 0,2% раствора бромтимолблау, и разливают по стерильным пробиркам ( по 0,5 мл.). Стерилизуют автоклавированием 15 минут при 1120С. Перед употреблением столбик среды окрашивают. Пересев культуры проводят с МПА, беря ее так, чтобы не захватить среду. Бульонная культура не используется. кишечная палочка на среде Симмонса не растет.

Приготовление индикатора бромтимолблау: бромтимолблау - 1г., 0,1N раствора NaOH -25 мл. дистиллированная вода - 475 мл. Цитратно-аммонийно позитивные бактерии дают рост с изменением среды в ярко-синий цвет. Микробы, не способные усваивать цитратные и аммонийные соли, на данной среде не растут и цвет среды не изменяется.

6. Определение способности бактерий расщеплять мочевину.

Рецепт среды: стерильный 1,7% питательный агар на мартеновском бульоне, рН -7,3 - 1000 мл. глюкозы -5г., 50%-ный раствор мочевины -20мл. 0,2%-ный раствор бромтимолблау -12 мл. Разливают в стерильные пробирки по 5 мл и стерилизуют один раз текучим паром 15 минут. Среду перед употреблением скашивают. Расщепление мочевины сопровождается изменением цвета среды с зеленоватого в ярко-синий, при отрицательной реакции среда становится желтой.

7. Обнаружение индола. Может быть проведено различными методами. Наиболее доступным и удобным способом обнаружения индола является метод с использованием индикаторных бумажек, приготовленных по одному из следующих рецептов: а) фильтровальную бумагу пропитывают насыщенным (12%) водным раствором щавелевой кислоты, затем бумагу высушивают на воздухе и разрезают на полоски размером 10 х 0,5 см. Хранят бумажки с щавелевой кислотой в стеклянной банке с притертой пробкой.

Для обнаружения индола засевают пробирки с МПБ или бульоном Хоттингера изучаемой культурой бактерий, вставляют в пробирку индикаторную бумажку, прижимая верхний конец ватно-марлевой пробкой (нижний край бумаги не должен касаться питательной среды). Инкубирование пробирок проводится при 370С 1-3 дня. При наличии индолообразования нижняя часть индикаторной бумажки окрашивается в розовый цвет (просматривать при проходящем свете). б) Фильтровальную бумагу пропитывают теплой смесью, состоящей из пара-диметил-амидобензальтегида -3-5г., 960 спирта-ректификата -50 мл. фосфатной кислоты (очищенной, концентрированной) - 10 мл. Бумагу высушивают на воздухе и разрезают на полоски. Цвет готовых бумажек желтый. Хранить следует в стеклянной банке с притертой пробкой.

Обнаружение индола проводят также, как и с бумажками, пропитанными щавелевой кислотой. При наличии нидола нижний край бумажки изменяет цвет, становится от сиренево-розового до интенсивно-малинового оттенка. Окрашивание индикаторами бумажки в другие цвета не учитывается.

    8. Обнаружение сероводорода. Проводят на плотной среде следующего состава, которую готовят в два этапа. 1 день - готовят агаровую основу - 10,7%-2% агара - 100 мл. Стерилизуют в автоклаве при 1200 30 минут, предварительно профильтровывая его. 2 день - добавляют сернокислое железо FeSO4 -0,2 г. гипосульфит -0,3 г., глюкозу -1г. индикатор фенолрот 0,3%-ный -12 мл.

Стерилизация текучим паром -20 минут. Посев проводят на окрашенный агар, проколов нижнюю часть столбика среды. При положительной реакции покрасневший столбик среды дает черную окраску в своей нижней части. При отрицательном результате почернения среды не наступает.

Похожие статьи




Этапы проведения бактериологического исследования - Ассоциативные болезни птиц

Предыдущая | Следующая