Генотипирование генетических маркеров - Анализ ассоциаций tagSNPs и гаплотипов генов LEP и ACVR2A с развитием гестоза в популяциях русских и якутов

В данной работе исследовано 9 полиморфных вариантов 2 кандидатных генов подверженности к гестозу: рецептора активина 2 типа (ACVR2A) и лептина (LEP). В таблице 3 представлена характеристика изученных полиморфных вариантов в генах(рис 8, 9).

локализация изученных полиморфизмов в гене acvr2a

Рисунок 8 - Локализация изученных полиморфизмов в гене ACVR2A

локализация изученных полиморфизмов в гене lep

Рисунок 9 - Локализация изученных полиморфизмов в гене LEP

Таблица 3 - Характеристика исследованных полиморфизмов генов-кандидатов

Ген и его

Локализация на хромосоме

SNPs

Замена

Предковый аллель

Локализация в гене (по данным базы NSBI)

LEP

7q31.3

Rs2278815

A/G

G

1 Интрон

Rs3828942

A/G

G

2 Интрон

Rs2167270

A/G

G

5'-UTR

Rs11763517

C/T

T

1 Интрон

Rs2071045

C/T

T

2 Интрон

ACVR2A

2q22.3

Rs1014064

A/G

A

1 Интрон

Rs1774234

A/C

A

1 Интрон

Rs1049725

C/G

C

3 Интрон

Rs2161984

A/G

G

9 Интрон

Генотипирование rs2278815, rs3828942, rs2167270 и rs11763517 гена LEP осуществляли с помощью амплификации соответствующих участков генома методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Генотипирование проводили на амплификаторе Applied Biosystems (США). ПЦР проводили в объеме 15 мкл в микроцентри-фужной пробирке типа "Эппендорф" со следующими компонентами реакции: ДНК (2 нг), дезоксирибонуклеозидтрифосфаты в эквивалентных концентрациях 2 мМ, термостабильная ДНК-Taq-полимераза (0,8 е. а.), праймеры (прямой и обратный), буфер, содержащий сульфат аммония, MgCl2 (25 мМ), деионизованная вода. Реакция амплификации включает несколько стадий: на первом этапе происходит денатурация молекулы ДНК, далее отжиг праймеров, при котором они гибридизуются с комплементарными последовательностями на разных цепях, после чего следует элонгация - этап основного синтеза ДНК. В результате 30 и более циклов наблюдается экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК [Щелкунов]. ПЦР проводили по схеме: начальная денатурация - 94°С (5 мин), затем 42 циклa амплификации в следующих условиях: денатурация - 94°С (40 с), отжиг - 60°С (40 с), элонгация - 72°С (40 с), после чего пробы инкубировали 3 мин при температуре 72°С. Структура праймеров, температура отжига, эндонуклеазы рестрикции и размеры фрагментов исследованных полиморфных вариантов генов описаны в таблице 4.

Продукты амплификации и рестрикции анализировались с помощью электрофореза в 2%, 3 % агарозном геле и в 6%, 8% полиакриламидном геле, окрашенном бромистым этидием (рис. 10-13). Искомые бенды визуализировали в ультрафиолетовом трансиллюминаторе.

электрофореграмма разделения фрагментов днк амплифицированного участка rs2278815 гена lep в 3% агарозном геле

Рисунок 10 - Электрофореграмма разделения фрагментов ДНК амплифицированного участка rs2278815 гена LEP в 3% агарозном геле: 1 - маркер молекулярного веса pUC19/Msp I; 2 - гомозигота (AA); 3 - гомозигота (GG); 4 - гетерозигота

электрофореграмма разделения фрагментов днк амплифицированного участка rs3828942 гена lep в 3% агарозном геле

Рисунок 11 - Электрофореграмма разделения фрагментов ДНК амплифицированного участка rs3828942 гена LEP в 3% агарозном геле: 1 - гетерозигота; 2 - гомозигота (GG); 3 - гомозигота (AA)

электрофореграмма разделения фрагментов днк амплифицированного участка rs2167270 гена lep в 3% агарозном геле

Рисунок 12 - Электрофореграмма разделения фрагментов ДНК амплифицированного участка rs2167270 гена LEP в 3% агарозном геле: 1 - гетерозигота; 2 - гомозигота (AA); 3 - гомозигота (GG)

электорофореграмма разделения фрагментов днк амплифицированного участка rs11763517 гена lep в 3% агарозном геле

Рисунок 13 - Электорофореграмма разделения фрагментов ДНК амплифицированного участка rs11763517 гена LEP в 3% агарозном геле: 1 - гомозигота (TT); 2 - гомозигота (CC); 3 - гетерозигота

№

Локус

Последовательность праймеров

Температура отжига

Эндонуклеазы рестрикции

Температура рестрикции

Длина фрагментов ДНК

На электрофорезе

1

Rs2278815

F: 5'-ATTCGCAGAGCTGAGATGC-3'

R: 5'-CCCCCACCTCTACTCATCCT-3'

60?С

Bst4CI

55?С

Аллель А (209 и 49 п. о.) и аллель G (258 п. о.)

2

Rs3828942

F: 5'-TCTTCAGCAGAGGCCATGTA-3'

R: 5'-GCCAGTGTCTGGTCCATCTT-3'

60?С

RsaI

37?С

Аллель A (127 и 246 п. о.) и аллель G (373 п. о.)

3

Rs2167270

F: 5'-GGAGCTGGCGCTAGAAATG-3'

R: 5'-CAGCTCCCGGTAACCTTCT-3'

60?С

Bst4CI

60?С

Аллель A (189 и 110п. о.) и аллель G (299 п. о.)

4

Rs11763517

F: 5'-TCTTCAGCAGAGGCCATGTA-3'

R: 5'-GCCAGTGTCTGGTCCATCTT-3'

60?С

SmlI

55?С

Аллель С (228 и 131 п. о.) и аллель Т (373 п. о.)

Таблица 4 - Структура праймеров, температура отжига, эндонуклеазы рестрикции и размеры фрагментов исследованных полиморфных вариантов генов

Геноипирование rs2071045 гена LEP, rs1014064, rs1774234, rs1049725 и rs2161984 гена ACVR2A осуществляли методом Real Time-PCR, воспроизводимым с помощью линейных разрушаемых проб TaqMan Genotyping Assay от Applied Biosystems. В данном подходе олигонуклеотид, комплементарный продукту ПЦР, метят флоурофором и гасителем флуоресценции (возможно использование как концевого, так и внутреннего мечения олигонуклеотида). В отсутствие мишени флоурофор и гаситель сближены и флуоресценция подавлена (обычно по механизму флуоресцентно-резонансного переноса энергии). При накоплении соответствующего продукта реакции, проба гибридизируется на ампликон, что ведет к ее разрушению за счет 5'- эндонуклеазной активности Taq-полимеразы (рис. 14) (Holland et al.,1991; Livak, 2003). Интенсивность сигнала возрастает с каждым циклом ПЦР пропорционально накоплению ампликонов (Holland et al.,1991; Happich et al., 2000). В данном походе принципиально использование полимеразы с хорошо выраженной 5'- эндонуклеазной активностью[44].

схема работы

Рисунок 14 - Схема работы "разрушаемых проб": Пробы несут флуорофор (1) и гаситель флуоресценции (2). Пока проба находится в растворе, за счет близкого расположения, гаситель эффективно поглощает энергию флуорофора. В случае гибридизации со спецефическим продуктом реакции проба разрушается за счет 5'- эндонуклеазной активности полимеразы (3), что ведет к разобщению флоурофора и гасителя и возрастанию флоуресценции [44]. Таким образом, увеличение флуоресценции будет прямо пропорционально количеству наработанного ПЦР-продукта.

Для постановки TaqMan проб для исследуемых локусов готовили ПЦР смесь следующего состава (с расчетом на один образец ДНК=20 нг): готовая смесь для Real Time-PCR "Master Mix", включающая в состав дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, термостабильную ДНК-Taq-полимеразу, буфер, содержащий сульфат аммония и MgCl2; флюоресцентные праймеры, меченные FAM и HEX; деионизированная вода. Реакция проходила в амплификаторе "BIORAD", включала в себя следующие стадии: начальная денатурация в течении 10 минут при температуре 95°С, затем протекала денатурария при 92°С в течении 15 секунд и элонгация при 60°С в течении 1 минуты (40 циклов).Продукты амплификации визуализировались с помощью программы "Biorad CSF Manager" и выглядели в виде схемы (рис. 15).

схема результатов real time-pcr

Рисунок 15 - Схема результатов Real Time-PCR

Похожие статьи




Генотипирование генетических маркеров - Анализ ассоциаций tagSNPs и гаплотипов генов LEP и ACVR2A с развитием гестоза в популяциях русских и якутов

Предыдущая | Следующая