Выделение и очистка ДНК - Идентификация коллекционных культур бактерий современными масс-спектрометрическими и молекулярно-генетическими методами

Выделение и очистку ДНК проводили методом по (Current protocols in, 1994). Для проведении ПЦР культуры выращивали в пробирках на среде ВКМ №55 при температуре 28 єС в течение 48 ч. В пробирку с чистой культурой вносили 1 мл буфера ТЕ[Трис-HCl - 10мМ, ЭДТА - 1мМ, pH 8.0, H2O], не вынимая пипетку перемешивали. Полученную суспензию клеток микроорганизмов помещали в пробирку типа "Eppendorf" на 1.5 мл, далее добавляли лизоцими оставляли на час при температуре 37 єС в твердотельном термостате "Гном" ("ДНК-Технология"). Затем ресуспендировали 200 мкл в микроцентрифужную пробирку. Объем доводили до 280 мкл буфером ТЕ. Добавляли 7 мкл 20%-ого SDS (sodium dodecyl sulfate, додецил сульфат натрия), выдерживали 1.5 ч при температуре 37 єС. Затем вносили 1.5 мкл фермента РНКазы А (10 мг/мл), выдерживали 1.5 ч при 37 єС, и 6 мкл фермента ПроК (протеиназа К) (10 мг/мл), выдерживали 1 ч при 37 єС. Добавляли 22 мкл 20%-ого SDS, оставляли на 15 мин при 55 єС. Добавляли 44 мкл 5М NaCl до конечной концентрации 0.7М и 36 мкл СТАВ, выдерживали 30 мин при 65 єС. Экстракцию проводили 400 мкл смеси фенол/хлороформа (1:1), перемешивали 5-10 мин до получения однородной эмульсии и центрифугировали при 14500 об/мин в течение 10 мин, затем отбирали верхнюю водную фазу в отдельную микроцентрифужную пробирку. Проводили экстракцию равным объмом хлороформа, также перемешивали в течение 5-10 минут и центрифугировали при 14500 об/мин 10 мин, отбирали верхнюю водную фазу. Осаждали ДНК 0.6V изопропилового спирта, промывали 70%-ым этанолом два раза (по 700 мкл) в течние 2 ч и один раз 150 мкл 96%-ого этанола в течение 5-10 мин.

Похожие статьи




Выделение и очистка ДНК - Идентификация коллекционных культур бактерий современными масс-спектрометрическими и молекулярно-генетическими методами

Предыдущая | Следующая