Выделение и очистка ДНК - Идентификация коллекционных культур бактерий современными масс-спектрометрическими и молекулярно-генетическими методами
Выделение и очистку ДНК проводили методом по (Current protocols in, 1994). Для проведении ПЦР культуры выращивали в пробирках на среде ВКМ №55 при температуре 28 єС в течение 48 ч. В пробирку с чистой культурой вносили 1 мл буфера ТЕ[Трис-HCl - 10мМ, ЭДТА - 1мМ, pH 8.0, H2O], не вынимая пипетку перемешивали. Полученную суспензию клеток микроорганизмов помещали в пробирку типа "Eppendorf" на 1.5 мл, далее добавляли лизоцими оставляли на час при температуре 37 єС в твердотельном термостате "Гном" ("ДНК-Технология"). Затем ресуспендировали 200 мкл в микроцентрифужную пробирку. Объем доводили до 280 мкл буфером ТЕ. Добавляли 7 мкл 20%-ого SDS (sodium dodecyl sulfate, додецил сульфат натрия), выдерживали 1.5 ч при температуре 37 єС. Затем вносили 1.5 мкл фермента РНКазы А (10 мг/мл), выдерживали 1.5 ч при 37 єС, и 6 мкл фермента ПроК (протеиназа К) (10 мг/мл), выдерживали 1 ч при 37 єС. Добавляли 22 мкл 20%-ого SDS, оставляли на 15 мин при 55 єС. Добавляли 44 мкл 5М NaCl до конечной концентрации 0.7М и 36 мкл СТАВ, выдерживали 30 мин при 65 єС. Экстракцию проводили 400 мкл смеси фенол/хлороформа (1:1), перемешивали 5-10 мин до получения однородной эмульсии и центрифугировали при 14500 об/мин в течение 10 мин, затем отбирали верхнюю водную фазу в отдельную микроцентрифужную пробирку. Проводили экстракцию равным объмом хлороформа, также перемешивали в течение 5-10 минут и центрифугировали при 14500 об/мин 10 мин, отбирали верхнюю водную фазу. Осаждали ДНК 0.6V изопропилового спирта, промывали 70%-ым этанолом два раза (по 700 мкл) в течние 2 ч и один раз 150 мкл 96%-ого этанола в течение 5-10 мин.
Похожие статьи
-
ПЦР проводили в ДНК-амплификаторе "Gene Amp PCR System 9700" ("Applied Biosystems", США) с использованием бактериальных праймеров: прямого 27F и...
-
Для анализа масс-спектральных белковых профилей культуры выращивали на среде R2A (28С,48 ч). Клетки (~ одну колонию) переносили с помощью тонкого...
-
Штаммы, используемые в работе, находились в лиафилизированном состоянии. Лиофилизация ? процесс высушивания под вакуумом из замороженного состояния....
-
В настоящее время в систематике бактерий осуществляется пересмотр сложившихся представлений, который благодаря своему бурному характеру и значению...
-
Материал для исследования следует брать по возможности до начала химиотерапии и лучше во время вскрытия или дренирования гнойного очага. Особенно...
-
Работа проводилась на базе Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) им. Г. К. Скрябина РАН....
-
Всероссийская коллекция микроорганизмов Всероссийская коллекция микроорганизмов (ВКМ) функционирует как центр сбора, изучения, поддержания и...
-
Систематика микроорганизмов - наука, изучающая разнообразие видов микроорганизмов и взаимоотношения между ними [Goodfellow, O'Donell, 1993]. Основной...
-
Криолитозона представляет собой лучший природный палеобанк биологических, геологических, экологических, климатических и других данных [Gilichinsky,...
-
По результатам проделанной работы можно сделать следующие выводы: 1. На основании полученных морфологических и культуральных признаков микроорганизмов,...
-
В работе было использовано 45 (204, 205, 207, 210, 222, 223, 224, 250, 251, 3.15, 3.16, 3.17, 3.25, 3.26, 3.28, 3.58, 3.59, 3.70, 3.74, 3.73, 3.76, 3.92,...
-
Микроорганизмы играют огромную роль в природных процессах и в течение многих лет являются "полигоном", где современная наука исследует фундаментальные...
-
Объект и предмет исследования В качестве Объекта исследования была выбраны сельскохозяйственные культуры: горох (( Pisum sativum L.), сорта...
-
Возбудитель скарлатины. Хар-ка - Частная микробиология
Семейство-Sreptococacea включает 6 родов опасных для человека: Streptococcus, Aerococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus. Стрептококки....
-
Кора больших полушарий. Современные методы исследования функций мозга - Предмет и задачи физиологии
"Мозг - это последняя из тайн природы, Которая когда-либо откроется человеку." Англ. физиолог Чарлз Скотт Шеррингтон. "Асимметрия является основным...
-
"Малые формы" физической культуры Мы рассмотрели ряд факторов, вызывающих общее утомление в течение рабочего дня. Величина определенного времени, после...
-
Этапы проведения бактериологического исследования - Ассоциативные болезни птиц
1 день- Вскрытие трупов, посевы из внутренних органов на МПБ и МПА 2 день - При росте типичных для эшерихий колоний, снятие 2-3 характерных колоний и...
-
Клініко-фізіологічне обгрунтування Після операції у хірургічних хворих виникають розлади, зумовлені як самим захворюванням, так і порушеннями в...
-
Опыты по испытанию нового препарата "Биотон" на микробную культуру сальмонелл. Опыты проводилась в городском санитарно-эпидемиологическом центре г....
-
Особый лечебный метод - Выращивание кактусов в условиях школьного кабинета биологии
Особый лечебный метод (или корневая ванна) для кактусов с поврежденной корневой системой, применяемый при пересадке. Бывает так, что кактус видимо,...
-
Нетрадиционные методы лечения ХПН, Фитотерапия - Хроническая почечная недостаточность
Фитотерапия Требуется: 40 г листьев березы белой Листья залить 4 стаканами кипятка, кипятить в течение 20-30 минут. Процедить Принимать по 1 стакану 3-4...
-
Законы наследственности, Достижения современной цитологии - Цитологические исследования
Второй этап в развитии цитологии как науки охватывает 1900-1935. Он наступил после того, как в 1900 были вторично открыты основные законы...
-
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) - Перспективная наука геномика
В 1985 году К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной...
-
Определение активности церулоплазмина. Активность Цп определяли по методу Тэна Э. В. (175). В пробирку вносили 0,1 мл сыворотки крови, 1 мл 0,4М...
-
Методы клонального микроразмножения - Биотехнология микроклонального размножения особей
Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году,...
-
Анамнез болезни - Основные методы обследования больного при различных заболеваниях
При расспросе о развитии самой болезни (anamnesis morbi) нужно получить точные ответы на следующие вопросы: 1) когда началось заболевание; 2) как оно...
-
Испытуемый раствор вводят 3 здоровым кроликам массой 1,5-2,5 кг в ушную вену из расчета 10 мл на 1 кг массы тела кролика. Раствор лекарственного вещества...
-
ВР.1 Подготовка помещений, ампул, оборудования, персонала. По Белорусской Фармакопее к стерильным растворам предъявляются следующие требования:...
-
Современные стандартизованные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам подразделяют на две группы: 1. Диффузные...
-
Сифилис (Lues) - инфекционное заболевание, имеющее длительное, волнообразное течение. По объему поражения организма сифилис относится к системным...
-
Таксономия: отдел Gracilicutes, род Francisella. Возбудитель - Francisella tularensis. Морфология: мелкие кокковидные полиморфные палочки, неподвижные,...
-
Род Klebsiella. Род Klebsiella относится к семейству энтеробактерий. Особенность представителей рода -- способность образовывать капсулу. Основной вид --...
-
Клостридии ботулизма - Частная микробиология
Клостридии ботулизма (CI. botulinum) были выделены в 1895 г. ван Эрменгемом из остатков пищи и органов людей, умерших от ботулизма. Морфология и...
-
Менингококки - Частная микробиология
Морфология и биологические свойств. Менингококк относится к роду нейссерий (Neisseria), который включает, помимо менингококка, ряд непатогенных...
-
История культуры. - Экологические группы растений по отношению к свету, воде и теплу
Гранат претендует на одно из первых мест в самых ранних анналах истории, поскольку по своему потребительскому значению он занимал у первобытных людей...
-
Исследования полостных или трубчатых органов, заключающиеся в непосредственном осмотре их внутренней поверхности с помощью особых приборов - Эндоскопов...
-
Основаны на регистрации электропотенциалов или звуковых явлений, возникающих в работающем органе. Электрокардиография (ЭКГ) - Метод, основанный на...
-
Общие методы изучения вирусов - Строгие постулаты Коха
О присутствии вируса в организме как при спонтанном заболевании, так и при экспериментальном заражении хозяина судят по появлению тех или иных...
-
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальність теми. Більшість відомих на сьогодні антибіотиків, які успішно використовуються в медицині, ветеринарії і...
-
Официальные данные Ф. И.О Возраст: 73 года Место работы: пенсионер Дата выписки: 3 февраля 2011 г. Диагноз: Основной: СД 2 тип. Ожирение 2 степени....
Выделение и очистка ДНК - Идентификация коллекционных культур бактерий современными масс-спектрометрическими и молекулярно-генетическими методами