Денатурація ферменту, Визначення амілолітичної (декстринуючої) активності - Вплив температури на активність амілаз

Температура, при якій фермент має максимальну активність, називається оптимальною температурою ферменту. Інтерес представляють дані про вплив на швидкість ферментативної реакції низьких температур. Зниження температури нижче оптимальної тимчасово сповільнює активність ферменту в силу зменшення швидкості дифузії молекул. Коли ж температуру знов підняти до оптимальної величини - активність ферменту і швидкість реакції відновиться.

Графічна залежність швидкості більшості ферментативних реакцій від температури має дзвіноподібну форму.

Вплив температури на швидкість реакції, яка каталізується ферментом: а - підвищення швидкості реакції як функція температури; б - зниження швидкості реакції як функція денатурації білку - ферменту; - стрілка вказує на оптимум температури.

Визначення амілолітичної (декстринуючої) активності

Амілази каналізують гідроліз високомолекулярних полісахаридів крохмалю і глікогену. Найважливішим джерелом амілаз є злакові, які містять їх як у не пророщеному, так і пророщеному зерні. В останньому випадку амілази проявляють високу активність.

Широко застосовуються амілази у крохмале-патоковому, спиртовому. Пивоварному і хлібопекарському виробництвах як головні ферменти, що каналізують процеси розщеплення крохмалю й утворення цукрі, що можуть зброджуватись.

Амілолітичну активність характеризує здатність ферментів каталізувати гідроліз крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом.

Метод характеризує активність б - амілази, але при наявності в препараті в - амілази і глюкоамілази цим методом визначають сумарну дую всіх амілолитичних ферментів.

За одиницю амілолітичної активності прийнято таку кількість ферменту, що каталізує розщеплення 1 г розчиненого крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом, за 1 год при температурі 30°С у чітко визначених умовах. Амілолітичну здатність (АЗ) препарату виражають числом указаних одиниць в 1 г сухого препарату чи в 1 мл розчину. При такому способі вираження АЗ безпосередньо показує скільки грамів крохмалю може бути прогудролізовано до нездатних забарвлюватись йодом декстринів 1 г препарату, культури чи 1 мл розчину за 1 год.

Мета роботи: засвоїти методику визначення амілолітичої здатності ферментного препарату.

Принцип методу грунтується на гідролізу 1,0 %-го буферного розчину крохмалю під впливом амілолитичних ферментів. Кінець реакції контролюють візуально за йодною пробою. За часом, протягом якого проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, визначається амілолітична активність препарату.

Хід роботи. У конічну колбу місткістю 50- 100 мл вносять піпеткою 20 мл 1,0 %-го розчину крохмалю і занурюють у водяну баню з температурою 30 °С (±0,2°С). Загальний об'єм реакційної суміші завжди має дорівнювати 30 мл, і якщо на аналіз беруть менше 10 мл ферментного розчину. То об'єм, якого не достає, доповнюють дистильованою водою, яку приливають перед додаванням ферментного розчину.

Через 10хв витримування в бані у колбу вносять ферментний розчин при ретельному перемішуванні і точно за секундоміром відмічають час. За початок реакції беруть час, коли з піпетки виллється половина вмісту. Через кожну хвилину після початку реакції скляною паличкою відбирають краплину рідини і на білій порцеляновій пластинці з'єднують її з раніше нанесеною краплиною робочого розчину йоду.

Реакція розщеплення крохмалю вважається закінченою, коли йод перестане давати зміну забарвлення при з'єднанні з краплиною дослідної рідини (протягом перших 10с).

Час, за який проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, може становити від 3 до 20 хв, але надійніші результати отримують у межах від 5 до 15 хв.

Примітка. Якщо час зникнення забарвлення менше 3 хв, то визначення повторюють з меншою кількістю розчину фермента, наприклад - 2 мл. У цьому разі в пробірку чи колбу з 20 мл крохмалю вносять 8 мл дистильованої води. Під час аналізу дуже активних препаратів концентрації розчинів роблять меншими (0,1 г в 200 або 500 мл).

Якщо час зникнення забарвлення становить більше 20 хв, то готують розчин більшої концентрації, наприклад 1:50 чи 1:100, а рідину можна не розбавляти зовсім.

У разі зникнення забарвлення в межах 3-5 хв проби відбирають кожні 15 с; 5 - 10 хв - кожні 30 с, а понад 10 хв - кожну хвилину.

Скляну паличку після кожної проби промивають дистильованою водою і витирають чистим некрохмаленим рушником.

Похожие статьи




Денатурація ферменту, Визначення амілолітичної (декстринуючої) активності - Вплив температури на активність амілаз

Предыдущая | Следующая