Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) - Перспективная наука геномика
В 1985 году К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод заключается в том, что к анализируемому образцу ДНК добавляют в избытке два синтетических олигонуклеотида - праймера размером около 20 нуклеотидов. Каждый из них комплементарен одному из 3-концов фрагмента ДНК. При нагревании разделяются цепи ДНК, а затем при охлаждении происходит гибридизация праймеров с комплиментарными участками нитей ДНК и начинается синтез остальной последовательности нити ДНК ферментом Taq-полимеразой, выделенной из термофильной бактерии Thermus aquaticus. Он термостабилен, выдерживает перепады температуры от 70°С до 100°С, оптиум работы фермента - 70°С. Реакция останавливается и ДНК снова денатурируется прогреванием. В процессе охлаждения праймеры, находящиеся в избытке, вновь эффективно гибридизуются, но уже не только с цепями исходной ДНК, но и с вновь синтезированными. Внесение в систему ДНК-полимеразы инициирует второй цикл полимеразной реакции. Многократное повторение описанной процедуры позволяет провести 30 и более циклов ферментативного удлинения праймеров. При этом число сегментов ДНК, ограниченных с обоих концов используемыми праймерами, с каждым циклом ПЦР увеличивается экспоненциально (приближается к зависимости 2n, где n -- число циклов). Выход всех других продуктов реакции увеличивается по линейной зависимости. Полученные фрагменты разделяют гель-электрофорезом, интересующий фрагмент выявляют с помощью специфичного генного зонда. Используя метод ПЦР, можно in vitro селективно обогащать препарат ДНК фрагментом с определенной последовательностью в миллион и более раз. Это позволяет надежно выявлять однокопийные гены и их варианты в таких больших и сложных геномах, каким является геном человека. Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 105 клеток. Получаемый сегмент ДНК надежно выявляется в виде дискретной полосы после электрофоретического разделения молекул ДНК и окраски их этидиум бромидом. Если к праймеру пришить фермент, то ферментная метка будет накапливаться при амплифицировании. Продукт амплификации проверяется по принципу ИФА, то есть добавляется субстрат и отмечается изменение окраски. В качестве метки можно использовать стрептавидин. Его можно пришивать как к праймеру, так и к нуклеотидам. В последнем случае нуклеотиды, меченные стрептавидином, добавляются к обычным, идущим на синтез комплементарной цепи ДНК. Этим достигается еще большее усиление сигнала. Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования.
Геномика молекулярный клонирование мюллис
Похожие статьи
-
Метод Сэнгера - Перспективная наука геномика
Второй метод, наиболее известный и популярный, разработанн Сэнгером и носящий его имя, основан не на химическом, а на ферментативном подходе. Cэнгер...
-
Метод гибридизации - Перспективная наука геномика
Гибридизация - метод выделения специфических последовательностей нуклеотидов. При нагревании водного раствора ДНК до 100оС и доведения рН до 13...
-
Заключение - Перспективная наука геномика
Благодаря тому, что генетический код универсален и все живые организмы способны расшифровывать генетическую информацию других организмов и осуществлять...
-
Понятие ген - Перспективная наука геномика
Структурной и функциональной единицей генома является ген. Ген контролирует развитие определенного признака или свойства организма. Совокупность генов...
-
Классификация генов - Перспективная наука геномика
Существует несколько классификаций генов. Большинство ученых придерживается двух приведенных ниже классификаций. Первая постулирует о наличии двух типов...
-
Введение - Перспективная наука геномика
В конце ХХ века началось интенсивное развитие молекулярной биологии, что создало предпосылки для планомерного изучения структуры геномов разных видов...
-
В настоящее время в систематике бактерий осуществляется пересмотр сложившихся представлений, который благодаря своему бурному характеру и значению...
-
Методы клонального микроразмножения - Биотехнология микроклонального размножения особей
Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году,...
-
Методы лабораторной диагностики инфекционных заболеваний - Частная микробиология
Существует 5 основных методов диагностики: 1) микроскопический -- позволяет обнаружить возбудителя непосредственно в материале, взятом от больного. Для...
-
Методы сбора и учета численности летающих насекомых - Изучение лесных беспозвоночных
Существует множество методик лова летающих беспозвоночных животных, однако практически ни одна из них не дает данных о плотности населения животных на...
-
ДНК-маркеры - Методы исследования популяции человека
Для изучения структуры генофонда и этногенеза современных популяций человека в качестве первых молекулярно-генетических маркеров стали использовать...
-
Научное познание: структура и методы - Естествознание - единая наука о природе
Структура научного познания Понятие метода и методологии (и границы научного метода) Классификация методов научного познания Главное назначение научной...
-
Современная биология и физико-химические методы - Биология как естественная наука
На протяжении всей истории развития биологии физические и химические методы были важнейшим инструментом исследования биологических явлений и процессов...
-
Физика как наука, цели, задачи и методы исследования - Физическая картина мира
Физика - наука, изучающая простейшие и вместе с тем наиболее общие закономерности явлений природы, свойства и строение материи, а также законы ее...
-
- сокращение + выделение секрета. - генерация нервного импульса - гиперполяризация мембраны - поляризация мембраны Возбудимость мышц изучают методом: -...
-
Полиморфные белки - Методы исследования популяции человека
Изучая генетическую структуру населения определенного региона проводятся исследования генетико-биохимического полиморфизма систем транспортных белков...
-
Ионизационное излучение не воспринимается органами чувств, следовательно, для их обнаружения используют те эффекты, которые визируют излучение на...
-
Ферментативные методы, Микробиологические методы - Методы количественного определения витамина B6
Определение коферментных форм витамина В6 ферментативными методами основано на реакции взаимодействия фосфорилированных форм витамина -...
-
Методы выявления биопленок - Использование микробных биопленок в промышленности
В настоящее время наиболее надежным методом подтверждения наличия микробной биопленки является специальная микроскопия. В первую очередь это конфокальное...
-
Сифилис (Lues) - инфекционное заболевание, имеющее длительное, волнообразное течение. По объему поражения организма сифилис относится к системным...
-
Основные методы, которые были использованы при исследовании видов рода Amanita Fr. - это среднемасштабный маршрутный метод исследования микобиоты и...
-
Генетические методы изучения биопленок - Использование микробных биопленок в промышленности
Для выявления генов, участвующих в генетическом контроле любого процесса, используются методы направленного и ненаправленного (инсерционного)...
-
Определение активности церулоплазмина. Активность Цп определяли по методу Тэна Э. В. (175). В пробирку вносили 0,1 мл сыворотки крови, 1 мл 0,4М...
-
Материал и методы исследования - Фауна рыб нижнего течения реки Гайва
Материал для данной работы был собран на р. Гайва Пермского края в весеннее-летне-осенний период с 6 мая по 11 сентября 2015 года, как во время...
-
Методы сбора и учетов численности беспозвоночных в кронах - Изучение лесных беспозвоночных
Среда обитания беспозвоночных, условно называемая нами "кроны", включает в себя ветви кустарников и деревьев, независимо от их размеров и высоты...
-
Б. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТКИ - Основные положения учения о клетке
1) Методы исследования структурной организации клетки. Световая микроскопия. * Получение четких изображений мелких (недоступных человеческому глазу)...
-
Утрата инфекционности, Серологические методы - Строгие постулаты Коха
Как правило, чувствительность вирионов данного вируса к действию тех или иных инактивирующих веществ определяется специфическими свойствами его белков,...
-
"Наша способность к самообмену по поводу работы собственного мозга почти безгранична главным образом потому, что часть, о которой мы можем сообщить,...
-
Выдающиеся ботанические научные труды и открытия 17 - 20 ст. № п/п Столетия, годы Автор труда или открытия Название труда или открытия Краткое содержание...
-
СОРТИРОВКА ХРОМОСОМ., СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК. - Генная инженерия
Следующий метод - это метод сортировки хромосом при опмощи цитофлюрометрии. Этот метод может быть использован в двух разных целях: 1) Для идентификации и...
-
Методы биологических исследований - Аналогия и моделирование в биологических исследованиях
Когда мы говорим о биологии, мы говорим о науке, которая занимается исследованием всего живого. Все живые существа, включая ареал их обитания, изучаются....
-
Пальпация - Основные методы обследования больного при различных заболеваниях
Пальпация (от лат. palpatio -- ощупывание) -- клинический метод исследования при помощи осязания с целью изучения физических свойств и чувствительности...
-
Введение - Основные методы обследования больного при различных заболеваниях
Распознать болезнь можно, зная ее проявления, умея найти только ей присущие изменения в организме. Для обнаружения и изучения разнообразных проявлений...
-
С позиции самоорганизации в развитии открытых неравновесных систем выделяется плавный (эволюционный) этап, на протяжении которого не происходит серьезных...
-
Методы и организация исследования Анализ литературных источников проводился на всех этапах исследования. Анализ специальной научно-методической...
-
Метод микрофигурии - Методы изучения клетки
С помощью микроманипулятора отдельные части клетки можно удалять, добавлять или каким-то образом видоизменять. Крупную клетку амебы удается разделить на...
-
Методы исследования Испытуемым на первом этапе было предложено ответить на вопросы о заинтересованности в психотерапии: - Хотите ли Вы обратиться к...
-
Не существует таких явлений природы, технических или социальных процессов, которые были бы предметом изучения математики, но при этом не относились бы к...
-
Общенаучные методы исследования - Методология научного исследования в естествознании
Процесс познания как основа любого научного исследования представляет собой сложный диалектический процесс постепенного воспроизведения в сознании...
-
Если повышенная реактивность трех форм гиперчувствительности немедленного типа опосредуется антителами (в основном классов IgE и IgG), то...
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) - Перспективная наука геномика