Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) - Перспективная наука геномика

В 1985 году К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод заключается в том, что к анализируемому образцу ДНК добавляют в избытке два синтетических олигонуклеотида - праймера размером около 20 нуклеотидов. Каждый из них комплементарен одному из 3-концов фрагмента ДНК. При нагревании разделяются цепи ДНК, а затем при охлаждении происходит гибридизация праймеров с комплиментарными участками нитей ДНК и начинается синтез остальной последовательности нити ДНК ферментом Taq-полимеразой, выделенной из термофильной бактерии Thermus aquaticus. Он термостабилен, выдерживает перепады температуры от 70°С до 100°С, оптиум работы фермента - 70°С. Реакция останавливается и ДНК снова денатурируется прогреванием. В процессе охлаждения праймеры, находящиеся в избытке, вновь эффективно гибридизуются, но уже не только с цепями исходной ДНК, но и с вновь синтезированными. Внесение в систему ДНК-полимеразы инициирует второй цикл полимеразной реакции. Многократное повторение описанной процедуры позволяет провести 30 и более циклов ферментативного удлинения праймеров. При этом число сегментов ДНК, ограниченных с обоих концов используемыми праймерами, с каждым циклом ПЦР увеличивается экспоненциально (приближается к зависимости 2n, где n -- число циклов). Выход всех других продуктов реакции увеличивается по линейной зависимости. Полученные фрагменты разделяют гель-электрофорезом, интересующий фрагмент выявляют с помощью специфичного генного зонда. Используя метод ПЦР, можно in vitro селективно обогащать препарат ДНК фрагментом с определенной последовательностью в миллион и более раз. Это позволяет надежно выявлять однокопийные гены и их варианты в таких больших и сложных геномах, каким является геном человека. Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 105 клеток. Получаемый сегмент ДНК надежно выявляется в виде дискретной полосы после электрофоретического разделения молекул ДНК и окраски их этидиум бромидом. Если к праймеру пришить фермент, то ферментная метка будет накапливаться при амплифицировании. Продукт амплификации проверяется по принципу ИФА, то есть добавляется субстрат и отмечается изменение окраски. В качестве метки можно использовать стрептавидин. Его можно пришивать как к праймеру, так и к нуклеотидам. В последнем случае нуклеотиды, меченные стрептавидином, добавляются к обычным, идущим на синтез комплементарной цепи ДНК. Этим достигается еще большее усиление сигнала. Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования.

Геномика молекулярный клонирование мюллис

Похожие статьи




Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) - Перспективная наука геномика

Предыдущая | Следующая