Циклическое лигазное секвенирование - Секвенирование ДНК

В 2007 г. компанией "Applied Biosystems" (теперь входит в состав корпорации "Life Technologies") была представлена платформа "SOLiD" на основе технологии циклического лигазного секвенирования. В данном методе также используют эмульсионную ПЦР, после которой каждая из микросфер содержит на своей поверхности около миллиона копий одного из исходных ДНК-фрагментов. Затем фрагменты ДНК денатурируют и модифицируют по 3? концу, что позволяет ковалентно связать миллиарды микросфер, покрытых фрагментами ДНК, с подложкой. Затем следует процесс циклического лигазного секвенирования. К одноцепочечной матрице ДНК присоединяют праймер и добавляют синтезированные флуоресцентно меченные восьмичленные олигонуклеотидные зонды. Каждый зонд в позиции 1 и 2 содержит два известных нуклеотида, которые в сочетании со следующими тремя основаниями должны иметь комбинацию последовательности, комплементарную соответствующим коротким фрагментам матрицы. Последние 3 основания, одинаковые (универсальные) для всех зондов, имеют на конце флуоресцентную метку. После того, как один из зондов компле - ментарно связывается с первыми пятью основания - ми от праймера на одноцепочечной матрице ДНК, лигаза сшивает его с праймером. При этом метка детектируется и удаляется вместе с последними тремя универсальными нуклеотидами зонда. Затем происходит сшивание (лигирование) другого зонда, комплементарно соединившегося со следующими пятью основаниями, от зонда уже присоединенного ранее и так далее до конца матрицы ДНК. После чего построенная комплементарная цепь удаляется, а к матрице добавляется праймер, который смещен по месту посадки на один нуклеотид относительно посадки предыдущего праймера, и весь процесс до - стройки второй цепи методом лигирования повторяется. Для определения полной последовательности секвенируемого фрагмента нужно провести эту процедуру с пятью праймерами, каждый из которых смещен относительно предыдущего праймера по месту посадки на один нуклеотид. Длина единичного фрагмента ДНК, секвенируемого методом лигирования, достигает 75 п. н. с точность до 99,99 %. Выпущенный компанией "Applied Biosystems" прибор "5500xl SOLiD System" способен за один цикл секвенировать 3 полных генома человека с 30-кратным покрытием и точностью 99,9999 % .

Похожие статьи




Циклическое лигазное секвенирование - Секвенирование ДНК

Предыдущая | Следующая