Метод Сэнгера - Перспективная наука геномика

Второй метод, наиболее известный и популярный, разработанн Сэнгером и носящий его имя, основан не на химическом, а на ферментативном подходе. Cэнгер использовал ДНК-полимеразу I, фермент, который участвует в процессе репликации, заполняя пробелы между вновь синтезированными фрагментами ДНК (фрагментами Оказаки). Для работы фермента в пробирке требуются предшественники ДНК - дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP), а также одноцепочечная матрица, на которой должен быть небольшой двухцепочечный участок - праймер, с которого начинается синтез Были также синтезированы модифицированные дидезоксирибонуклеотиды, в которых дезоксирибоза 3- ОН отсутствует, которые затем включает в ДНК ДНК-полимераза. Однако, включившись в ДНК, модифицированное основание не может образовать фосфодиэфирную связь со следующим дезоксирибонуклеотидом. В результате рост данной цепи останавливается в том месте, где в ДНК включился модифицированный dNTP. Реакционная смесь по Сэнгеру состоит из цепи исследуемой ДНК, прамеров, одного из четырех ddNTP и соответствующего dNTP в строго определенном соотношении (чтобы они конкурировали), а также остальных трех dNTP. Готовят четыре смеси, каждая из которых содержит один из четырех ddNTP. В каждой из пробирок образуется набор меченых фрагментов, длина которых зависит от местоположения дефектного. Полученные меченые фрагменты ДНК разделяют в полиакриламидном геле, проводят радиоавтографию и устанавливают нуклеотидную последовательность ДНК. В 1990-х годах метод был усовершенствован и автоматизирован. Вместо радиоактивной метки стали использовать флуоресцентные, что позволило использовать для каждого нуклеотида определенный цвет.

В настоящее время определение точной нуклеотидной последовательности любого сегмента ДНК умеренной длины быстрая, и не слишком трудоемкая задача. Так как появились секвенаторы нового поколения. К таким относятся illumine, SOLiD и другие. Также есть информация о появлении секвенаторов третьего поколения, но они пока уступают по эффективности второму поколению.

В 1996 году был секвенирован геном дрожжей, в 1998 г. - геном арабидопсиса, в 2000 году - геном человека, однако в данном случае речь идет только об установлении последовательности нуклеотидов, так как генетическая структура и функции отдельных участков генома еще не идентифицированы. На современном этапе любой человек за "кругленькую"сумму может сделать свою генетическую карту за неделю.

Похожие статьи




Метод Сэнгера - Перспективная наука геномика

Предыдущая | Следующая