"Классический" метод Сэнгера (ферментативный) - Секвенирование ДНК
В настоящее время "метод терминации цепи", или "дидезокси метод", разработанный в 70-х гг. прошлого века Фредериком Сэнгером, является самым распространенным на сегодняшний день способом секвенирования ДНК. Дешевизна, точность, а также сравнительная простота автоматизации делает этот метод своеобразным "золотым стандартом" среди всех существующих на сегодняшний день способов определения последовательности ДНК. Данным способом был расшифрован весь геном человека, и именно метод Сенгера до сих пор является рутинным в повседневной лабораторной практике. В своей работе Сенгер - использовал меченые атомы, что позволило ему работать с ничтожно малым количеством экспериментального материала - порядка микрограммов. В 1977 Сенгер и его коллеги продемонстрировали результативность своего метода, установив последовательность оснований в цепи ДНК бактериального вируса, длина которой составила более 5000 пар оснований. Это был первый случай такой подробной расшифровки цепи ДНК. В журнале "Nature" им был опубликован полный список этой последовательности для нуклеотидов ДНК фага ФХ174, т. е. его химическая формула. В результате исследований в области нуклеиновых кислот в 1980 Сенгеру и американцу У. Гилберту была присуждена половина Нобелевской премии "за вклад в определение последовательности оснований в нуклеиновых кислотах". Другая половина премии была присуждена американцу П. Бергу. Таким образом, Сенгер стал единственным дважды Нобелевским лауреатом по химии (1958 и 1980).
Для постановки реакции секвенирования Сенгер с коллегами делали следующие манипуляции. Раствор с праймером распределяли по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них -- меченный радиоактивным изотопом) и один из четырех дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каждой из четырех пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, начинающийся с праймерной последовательности. Далее в пробирки добавляли формамид для расхождения цепей и проводили электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках, с последующей радиоавтографией, которая позволяет "прочесть" нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК.
В 1990-х метод Сенгера претерпел важные усовершенствования. Радиоактивное мечение заменили флуоресцентным. То есть к каждому из нуклеотидов-терминаторов присоединили флуоресцентную метку своего цвета. Это позволило совместить четыре реакции синтеза в одной пробирке, а также автоматизировать считывание электрофореза: продукты реакции детектировали фотодатчики на выходе из геля. Короткий фрагмент ДНК называемый праймером, инициирует синтез ДНК в определенной точке цепи ДНК-матрицы. Фермент - ДНК-полимераза синтезирует цепь ДНК полностью комплементарную последовательности ДНК матрицы. При этом видоизмененные разновидности нуклеотидов, которые присутствуют в реакционной смеси в значительно меньших количествах, чем обычные нуклеотиды, обрывают синтез, когда один из них оказывается на конце растущей ДНК-цепи. (Все дело в том, что видоизмененные нуклеотиды не имеют той самой химической группы, к которой должен присоединяться следующий нуклеотид для продолжения цепи). В результате получается смесь, содержащая полный набор ново - синтезированных фрагментов ДНК, каждый из которых начинается в одном и том же месте, но заканчивается во всех возможных положениях вдоль цепи ДНК-матрицы. Современные автоматизированные секвенаторы разделяют эти фрагменты, пропуская всю смесь через тончайшие капилляры, наполненные полимером. Чем короче фрагмент, тем быстрее он движется в геле по капилляру под действием электрического поля. Фрагменты ДНК -- по сути, ионы, движущиеся в электрическом поле от "минуса" к "плюсу". Процесс, называемый капиллярным электрофорезом, настолько эффективен, что фрагмент, только что вышедший из капилляра, оказывается ровно на один нуклеотид длиннее, чем предшествующий ему. Во время электрофореза луч лазера в определенном месте геля возбуждает флуоресценцию красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель. Таким образом регистрируя последовательность появления нуклеотидов, прибор складывает "буквы" (нуклеотиды) в "текст" (последовательность ДНК). В настоящее время определение точной нуклеотидной последовательности любого сегмента ДНК умеренной длины - вполне разрешимая задача. Уже определена последовательность нескольких сотен генов про - и эукариот. Зная последовательность гена и генетический код, легко определить аминокислотную последовательность кодируемого им белка. Определение последовательности ДНК привело также к тому, что были обнаружены области, которые не кодируют белки, но принимают участие в регуляции экспрессии генов и репликации ДНК. В 1996 году был секвенирован геном дрожжей, в 1998 г. - геном арабидопсиса, в 2000 году - геном человека.
Похожие статьи
-
Метод Сэнгера - Перспективная наука геномика
Второй метод, наиболее известный и популярный, разработанн Сэнгером и носящий его имя, основан не на химическом, а на ферментативном подходе. Cэнгер...
-
Ферментативные методы, Микробиологические методы - Методы количественного определения витамина B6
Определение коферментных форм витамина В6 ферментативными методами основано на реакции взаимодействия фосфорилированных форм витамина -...
-
В настоящее время в систематике бактерий осуществляется пересмотр сложившихся представлений, который благодаря своему бурному характеру и значению...
-
Методы расшифровки нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот в отечественной литературе принято называть методами секвенирования. молекулярный...
-
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) - Перспективная наука геномика
В 1985 году К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной...
-
Научное познание: структура и методы - Естествознание - единая наука о природе
Структура научного познания Понятие метода и методологии (и границы научного метода) Классификация методов научного познания Главное назначение научной...
-
СОРТИРОВКА ХРОМОСОМ., СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК. - Генная инженерия
Следующий метод - это метод сортировки хромосом при опмощи цитофлюрометрии. Этот метод может быть использован в двух разных целях: 1) Для идентификации и...
-
ВВЕДЕНИЕ Близнецовый психогенетический наследственность генотип Психогенетика - наука о наследственности и изменчивости психических свойств, возникшая на...
-
Статистические методы - Методы исследования популяции человека
Статистика Нея На основании данных о численностях фенотипов рассчитывают частоты соответствующих аллелей всех исследованных полиморфных систем, величину...
-
Система методов технических медицинских исследований - Научные основы приборостроение в медицине
Инструментальные средства медико-биологических исследований представляют собой совокупность приборов, аппаратов, систем, комплексов и приспособлений к...
-
Дополнительные методы мониторинга - Синантропная флора Дальнего Засвияжья г. Ульяновска
1) Фенологические (сезонные) наблюдения - жизнедеятельности живых организмов и природной среды - одна из существенных частей мониторинга. Фенология - это...
-
Оценка случайного инбридинга методом изонимии - Методы исследования популяции человека
Фамилия - основная часть триединого полного русского именования человека - является очень интересным словом, которое может расцениваться и как памятник...
-
Утрата инфекционности, Серологические методы - Строгие постулаты Коха
Как правило, чувствительность вирионов данного вируса к действию тех или иных инактивирующих веществ определяется специфическими свойствами его белков,...
-
Для расчета контраста изображений кристаллических тел, имеющих регулярные структуры, а также для решения обратной задачи -- расчета структуры объекта по...
-
Понятие "метод" (от греч. "методос" -- путь к чему-либо) означает совокупность приемов и операций практического и теоретического освоения...
-
Не существует таких явлений природы, технических или социальных процессов, которые были бы предметом изучения математики, но при этом не относились бы к...
-
Физика как наука, цели, задачи и методы исследования - Физическая картина мира
Физика - наука, изучающая простейшие и вместе с тем наиболее общие закономерности явлений природы, свойства и строение материи, а также законы ее...
-
"Обзорный" метод - Методы исследования популяции человека
Наиболее полноценным методом проведения популяционно-генетических исследований является "обзорный". Данный метод позволяет проводить обследование и...
-
Методы сбора и учета численности летающих насекомых - Изучение лесных беспозвоночных
Существует множество методик лова летающих беспозвоночных животных, однако практически ни одна из них не дает данных о плотности населения животных на...
-
Методы культивирования биопленок В последнее десятилетие произошло значительное расширение возможности изучения формирования микробных биопленок....
-
Понятие "стресс-теста" в кардиологии включает в себя оценку функционального резерва и состояния сердечно-сосудистой системы при выполнении различных...
-
Основные методы, которые были использованы при исследовании видов рода Amanita Fr. - это среднемасштабный маршрутный метод исследования микобиоты и...
-
Систематика микроорганизмов - наука, изучающая разнообразие видов микроорганизмов и взаимоотношения между ними [Goodfellow, O'Donell, 1993]. Основной...
-
Всероссийская коллекция микроорганизмов Всероссийская коллекция микроорганизмов (ВКМ) функционирует как центр сбора, изучения, поддержания и...
-
Материал исследования Исследования проводили в период вегетативного сезона 2011-2015 гг. Сбор осуществляли преимущественно маршрутным методом. В ходе...
-
6.1 манифестная форма (на ЭКГ признаки предвозбуждения желудочков в виде дельта-волны) 6.2 преходящая форма (эпизоды ЭКГ, на которых регистрируются...
-
В медицинской микробиологии все шире используются методы генной инженерии, с помощью которых "заставляют" микроорганизмы продуцировать нужные медицинской...
-
ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД - Методы исследования вирусов
Иммунофлюоресцентный метод, или реакция иммунофлюоресценции (РИФ), используется в микробиологических лабораториях, оборудованных люминесцентным...
-
"Наша способность к самообмену по поводу работы собственного мозга почти безгранична главным образом потому, что часть, о которой мы можем сообщить,...
-
Радиоизотопные методы - Участие медицинской сестры в инструментальных исследованиях пациента
Основаны на способности органов (печень, щитовидная железа, поджелудочная железа) накапливать и с определенной скоростью выводить радиоактивные вещества....
-
Материал для исследования следует брать по возможности до начала химиотерапии и лучше во время вскрытия или дренирования гнойного очага. Особенно...
-
ИММУНОЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ - Методы исследования вирусов
Представляет собой непосредственную визуализацию взаимодействия антигена и антител методом электронной микроскопии, была впервые предложена для...
-
Введение - Биологическая активность бионаночастиц серебра, полученных методом "Зеленого" синтеза
В последнее время интерес в развитии новых стратегий для формирования бионаночастиц серебра проистекает от их потенциального применения в различных...
-
Инструментальное научение - Классические условные рефлексы
В то время как исследование классических условных рефлексов было начато в России, принципы инструментальных условных рефлексов были открыты и разработаны...
-
Расшифровка генетической информации - ДНК
Полимерные цепи белков состоят из мономерных звеньев - аминокислот и последовательность расположения их в белковой молекуле строго специфична. В связи с...
-
Методы сбора и учетов численности беспозвоночных в кронах - Изучение лесных беспозвоночных
Среда обитания беспозвоночных, условно называемая нами "кроны", включает в себя ветви кустарников и деревьев, независимо от их размеров и высоты...
-
Математика представляет собой науку, расположенную как бы на границах естествознания. Вследствие этого ее иногда рассматривают в рамках концепций...
-
Полиморфные белки - Методы исследования популяции человека
Изучая генетическую структуру населения определенного региона проводятся исследования генетико-биохимического полиморфизма систем транспортных белков...
-
ДНК-маркеры - Методы исследования популяции человека
Для изучения структуры генофонда и этногенеза современных популяций человека в качестве первых молекулярно-генетических маркеров стали использовать...
-
Биологическими маркерами принято считать устойчивые биохимические, физиологические, анатомические и иные признаки организмов, варьирующие в норме в...
"Классический" метод Сэнгера (ферментативный) - Секвенирование ДНК