"Классический" метод Сэнгера (ферментативный) - Секвенирование ДНК

В настоящее время "метод терминации цепи", или "дидезокси метод", разработанный в 70-х гг. прошлого века Фредериком Сэнгером, является самым распространенным на сегодняшний день способом секвенирования ДНК. Дешевизна, точность, а также сравнительная простота автоматизации делает этот метод своеобразным "золотым стандартом" среди всех существующих на сегодняшний день способов определения последовательности ДНК. Данным способом был расшифрован весь геном человека, и именно метод Сенгера до сих пор является рутинным в повседневной лабораторной практике. В своей работе Сенгер - использовал меченые атомы, что позволило ему работать с ничтожно малым количеством экспериментального материала - порядка микрограммов. В 1977 Сенгер и его коллеги продемонстрировали результативность своего метода, установив последовательность оснований в цепи ДНК бактериального вируса, длина которой составила более 5000 пар оснований. Это был первый случай такой подробной расшифровки цепи ДНК. В журнале "Nature" им был опубликован полный список этой последовательности для нуклеотидов ДНК фага ФХ174, т. е. его химическая формула. В результате исследований в области нуклеиновых кислот в 1980 Сенгеру и американцу У. Гилберту была присуждена половина Нобелевской премии "за вклад в определение последовательности оснований в нуклеиновых кислотах". Другая половина премии была присуждена американцу П. Бергу. Таким образом, Сенгер стал единственным дважды Нобелевским лауреатом по химии (1958 и 1980).

Для постановки реакции секвенирования Сенгер с коллегами делали следующие манипуляции. Раствор с праймером распределяли по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них -- меченный радиоактивным изотопом) и один из четырех дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каждой из четырех пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, начинающийся с праймерной последовательности. Далее в пробирки добавляли формамид для расхождения цепей и проводили электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках, с последующей радиоавтографией, которая позволяет "прочесть" нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК.

В 1990-х метод Сенгера претерпел важные усовершенствования. Радиоактивное мечение заменили флуоресцентным. То есть к каждому из нуклеотидов-терминаторов присоединили флуоресцентную метку своего цвета. Это позволило совместить четыре реакции синтеза в одной пробирке, а также автоматизировать считывание электрофореза: продукты реакции детектировали фотодатчики на выходе из геля. Короткий фрагмент ДНК называемый праймером, инициирует синтез ДНК в определенной точке цепи ДНК-матрицы. Фермент - ДНК-полимераза синтезирует цепь ДНК полностью комплементарную последовательности ДНК матрицы. При этом видоизмененные разновидности нуклеотидов, которые присутствуют в реакционной смеси в значительно меньших количествах, чем обычные нуклеотиды, обрывают синтез, когда один из них оказывается на конце растущей ДНК-цепи. (Все дело в том, что видоизмененные нуклеотиды не имеют той самой химической группы, к которой должен присоединяться следующий нуклеотид для продолжения цепи). В результате получается смесь, содержащая полный набор ново - синтезированных фрагментов ДНК, каждый из которых начинается в одном и том же месте, но заканчивается во всех возможных положениях вдоль цепи ДНК-матрицы. Современные автоматизированные секвенаторы разделяют эти фрагменты, пропуская всю смесь через тончайшие капилляры, наполненные полимером. Чем короче фрагмент, тем быстрее он движется в геле по капилляру под действием электрического поля. Фрагменты ДНК -- по сути, ионы, движущиеся в электрическом поле от "минуса" к "плюсу". Процесс, называемый капиллярным электрофорезом, настолько эффективен, что фрагмент, только что вышедший из капилляра, оказывается ровно на один нуклеотид длиннее, чем предшествующий ему. Во время электрофореза луч лазера в определенном месте геля возбуждает флуоресценцию красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель. Таким образом регистрируя последовательность появления нуклеотидов, прибор складывает "буквы" (нуклеотиды) в "текст" (последовательность ДНК). В настоящее время определение точной нуклеотидной последовательности любого сегмента ДНК умеренной длины - вполне разрешимая задача. Уже определена последовательность нескольких сотен генов про - и эукариот. Зная последовательность гена и генетический код, легко определить аминокислотную последовательность кодируемого им белка. Определение последовательности ДНК привело также к тому, что были обнаружены области, которые не кодируют белки, но принимают участие в регуляции экспрессии генов и репликации ДНК. В 1996 году был секвенирован геном дрожжей, в 1998 г. - геном арабидопсиса, в 2000 году - геном человека.

Похожие статьи




"Классический" метод Сэнгера (ферментативный) - Секвенирование ДНК

Предыдущая | Следующая