Возможность перекрестной реакции., Изменчивость микроорганизмов., Разновидности ПЦР - Полимеразная цепная реакция

Подбор праймеров происходит на основе существующих знаний о геноме данного и сходных микроорганизмов. Теоретически существует возможность присутствия такого же фрагмента и у других микроорганизмов, геном которых в настоящее время не расшифрован, и которые не были протестированы на возможность перекрестной реакции. Присутствие в пробе таких микроорганизмов может привести к ложноположительному результату анализа.

Изменчивость микроорганизмов.

Хотя при конструировании тест-системы фрагмент генома, используемый для амплификации, выбирается из высоко консервативной области, изменчивость микроорганизмов может приводить к тому, что некоторые генотипы или штаммы исследуемого возбудителя могут приобретать мутации в амплифицируемом участке генома, и, таким образом, становиться неуловимыми данной тест-системой.

Возбудителя), которые должна выдержать тест-система, прежде чем она попадет на рынок.

Разновидности ПЦР
    - "Вложенная" ПЦР) -- применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции. - "Инвертированная" ПЦР) -- используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов. В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно. - ПЦР с обратной транскрипцией) -- используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены. - Асимметричная ПЦР -- проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке. - Количественная ПЦР) -- используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе. - Количественная ПЦР в реальном времени -- в этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления. - Touchdown ПЦР) -- с помощью этого метода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают. При определенной температуре система пройдет через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК. - Метод молекулярных колоний -- акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний. - ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК - ПЦР длинных фрагментов -- модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК. Используют две полимеразы, одна из которых -- Taq-полимераза с высокой процессивностью, а вторая -- ДНК полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесенные первой. - RAPD PCR. Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия, удается добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов. - PCR с использованием горячего старта и нижней смесей с целью недопущения раннего смешивания компонентов реакции. До начала реакции амплификатор необходимо прогреть до температуры плавления парафина.

Похожие статьи




Возможность перекрестной реакции., Изменчивость микроорганизмов., Разновидности ПЦР - Полимеразная цепная реакция

Предыдущая | Следующая