Материалы и методы исследования, Экспериментальные модели - Патофизиологическая роль церулоплазмина при лейкоцитозах и лейкопениях

Эксперименты выполнены на 350 белых беспородных крысах и крови 100 здоровых людей - доноров областной станции переливания крови.

Все исследования на животных выполнены в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1977).

Использовали препарат церулоплазмин (активность - 10 усл. ед. на 1 мг белка), произведенный в НПО "Иммунопрепарат" (г. Уфа). Перед введением препарат церулоплазмин растворяли в стерильном физиологическом растворе.

Экспериментальные модели

Для изучения роли Цп в условиях in vivo использовали интактных животных (таблица 2) и экспериментальные модели нарушения качественного и количественного состава лейкоцитов. Среди последних выделяли лейкоцитозы:

    - асептическое воспаление (таблица 3), - "невоспалительные" лейкоцитозы в ответ на экзогенный пироген и интоксикацию хлоридом бария (таблица 4);

И лейкопении:

    - цитостатическая лейкопения (таблица 5), - асептическое воспаление на фоне лейкопении (таблица 6).

Влияние Цп на процессы СРО в фагоцитирующих клетках периферической крови людей - доноров областной станции переливания крови изучали в модельных системах in vitro (таблица 7). Исследовали влияние Цп на адгезивную способность лейкоцитов к интактному и активированному эндотелию (таблица 8).

Таблица 2

Схема введения Цп интактным животным

Группа животных

Схема введения Цп

Исследование показателей

1.

Внутрибрюшинно,

30 мг/кг однократно

    30 минут, 5 сутки, 12 сутки

2.

Внутрибрюшинно,

10 мг/кг семикратно через 48 часов (суммарная доза 70 мг/кг)

    5 сутки, 8 сутки, 15 сутки

3.

Внутрибрюшинно,

30 мг/кг шестикратно через 48 часов (суммарная доза 180 мг/кг)

    3 сутки, 5 сутки, 12 сутки

Введение Цп интактным животным осуществляли для решения нескольких поставленных задач. Во - первых, для изучения влияния Цп на изменение количественного состава и функциональной активности лейкоцитов в условиях интактного организма. Во - вторых, для выбора оптимальной дозы Цп, которая могла быть использована в дальнейшем для изучения роли Цп при патологических процессах. В - третьих, для определения самостоятельности влияния Цп на количество и функцию лейкоцитов независимо от какого - либо патологического процесса. Суммарная доза Цп, введенная первой группе интактных животных составила 30 мг/кг (75% от физиологической концентрации Цп в сыворотке крови), второй группе - 70 мг/кг, а третьей - 180 мг/кг. Причем, первоначально изучали эффект однократного введения Цп, а показатели снимали через 30 минут после введения и на 5, 12 сутки, ожидая возможность пролонгированного действия Цп.

Таблица 3

Схема введения Цп при воспалении

Модель

Эксперимента

Группа животных

Схема введения Цп

Исследование показателей

Асептическое воспаление (1,0 мл скипидара под кожу спины)

Опыт

Внутрибрюшинно, 30 мг/кг двукратно через 6 и 12 часов от индукции воспаления (суммарная доза 60 мг/кг)

    3 сутки, 5 сутки

Контроль

Стерильный физиологический раствор

    3 сутки, 5 сутки

Асептическое воспаление (1,0 мл скипидара под кожу спины)

Опыт

Внутрибрюшинно,

60 мг/кг однократно на 3 сутки от индукции воспаления

    5 сутки, 8 сутки, 15 сутки

Контроль

Стерильный физиологический раствор

    5 сутки, 8 сутки, 15 сутки.

В качестве модели воспалительного процесса было выбрано асептическое воспаление, которое воспроизводили подкожным введением 1,0 мл скипидара (187). Суммарная доза вводимого Цп составила 60 мг/кг. Причем, первой группе животных Цп вводили в ранние сроки развития воспалительной реакции двукратно (через 6 и 12 часов от индукции воспаления), а второй группе - однократно на 3 сутки. Таким образом, изучали возможность влияния Цп на количество и функцию лейкоцитов в разные сроки воспалительного процесса.

Таблица 4

Схема введения Цп при "невоспалительных" лейкоцитозах

Модель

Эксперимента

Группа животных

Схема введения Цп

Исследование показателей

Пирогенал внутримышечно 5 мкг/кг

Однократно

Опыт

Внутрибрюшинно, 60 мг/кг однократно одновременно с введением пирогенала

    8 часов, 24 часа

Контроль

Стерильный физиологический раствор

    8 часов, 24 часа

Бариевая интоксикация

    (BaCl2 подкожно 10 мг/кг через 48 часов

В течение 20 суток).

Опыт

Внутрибрюшинно 30 мг/кг на 7, 10 и 13 сутки эксперимента (суммарная доза 90 мг/кг)

    11 сутки, 18 сутки, 22 сутки, 30 сутки.

Контроль

Стерильный физиологический раствор

    11 сутки, 18 сутки, 22 сутки, 30 сутки.

Термин "невоспалительные" лейкоцитозы использован для экспериментальных моделей патологических процессов, сопровождающихся развитием лейкоцитоза без альтерации тканей. Первой группе животных вводили экзогенный пироген - пирогенал по методике (165). Пирогенал представляет собой растворимый липополисахарид клеточной стенки Ps. аeruginosa (93). Введение пирогенала приводит к мобилизации костно - мозгового резерва лейкоцитов и развитию лейкоцитарной реакции периферической крови (112, 119, 125, 126). У второй группы животных вызывали бариевую интоксикацию путем подкожного введения хлористого бария в количестве 10 мг на кг массы тела в течение 20 суток. Показано, что бариевая интоксикация приводит к миелоидной гиперплазии костного мозга за счет увеличения продукции КСФ (77, 143).

Таблица 5

Схема введения Цп при лейкопении

Модель

Экперимента

Группа животных

Схема введения Цп

Исследование показателей

Циклофосфан внутрибрюшинно 250 мг/кг однократно

Опыт

Внутримышечно,

60 мг/кг однократно

Одновременно с введением циклофосфана

    4 сутки, 8 сутки, 12 сутки.

Контроль

Стерильный физиологический раствор

    4 сутки, 8 сутки, 12 сутки.

В качестве модели лейкопении была выбрана цитостатическая лейкопения, которую вызывали внутрибрюшинным введением циклофосфана (3, 40, 41). Для изучения влияния Цп на процессы регенерации лейкопоэза, подавленного цитостатиком, Цп вводили в суммарной дозе 60 мг/кг. Сроки исследования показателей определялись данными литературы о восстановлении лейкопоэза после воздействия цитостатика (39, 41, 192). После этого исследовали роль Цп при воспалительном процессе, протекающем на фоне цитостатической лейкопении.

Таблица 6

Схема введения Цп при воспалении на фоне лейкопении

Модель

Эксперимента

Группа животных

Схема введения Цп

Исследование показателей

Асептическое воспаление на 3 сутки цитостатической

Лейкопении (циклофосфан внутрибрюшинно 125 мг/кг однократно)

Опыт

Внутримышечно,

60 мг/кг однократно

Одновременно с введением циклофосфана

    4 сутки, 8 сутки, 11 сутки, 16 сутки.

Контроль

Стерильный физиологический раствор

    4 сутки, 8 сутки, 11 сутки, 16 сутки

Таблица 7

Схема применения Цп в экспериментах in vitro

Модель

Схема применения Цп

Исследование показателей

1.

Цп в дозах 12,5%; 25%; 50%; 75%; 100%; 150% от физиологического уровня в сыворотке крови добавляли в цельную кровь.

Хемилюминесценция цельной крови сразу после добавления растворов Цп.

2.

Цп в дозах 12,5%; 25%; 50%; 75%; 100%; 150% от физиологического уровня в сыворотке крови инкубировали 30 минут при 37оС с цельной кровью.

Хемилюминесценция цельной крови после 30 минут инкубации с растворами Цп.

Оценку дозо - зависимого влияния Цп на процессы СРО в фагоцитах изучали in vitro методом ХЛ цельной крови. Показано, что ХЛ цельной крови, усиленная люминолом, отражает способность фагоцитов генерировать активные формы кислорода (15, 60, 61, 176, 177). Применяли следующие дозы препарата (мг/мл): 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; что соответствовало 12,5%; 25%; 50%; 75%; 100%; 150% от его физиологической концентрации в сыворотке крови.

Таблица 8

Схема применения Цп при изучении адгезии лейкоцитов

Мо-дель

Схема применения Цп

Исследование показателей

1.

Цп в дозах 25%; 50%; 75%; 100%; 150% от физиологического уровня в сыворотке крови инкубировали 30 минут при 37оС с цельной кровью.

Адгезия лейкоцитов к интактному эндотелию после 30 минут инкубации с растворами Цп.

2.

Цп в дозах 25%; 50%; 75%; 100%; 150% от физиологического уровня в сыворотке крови обрабатывали эндотелий.

Адгезия лейкоцитов к обработанному Цп эндотелию.

3.

Цп в дозах 25%; 50%; 75%; 100%; 150% от физиологического уровня в сыворотке крови инкубировали 30 минут при 37оС с цельной кровью.

Адгезия лейкоцитов к активированному гистамином (1550 нмоль/л) эндотелию.

4.

Цп в дозах 25%; 50%; 75%; 100%; 150% от физиологического уровня в сыворотке крови обрабатывали активированный гистамином эндотелий.

Адгезия лейкоцитов к обработанному гистамином (1550 нмоль/л) и Цп эндотелию.

Похожие статьи




Материалы и методы исследования, Экспериментальные модели - Патофизиологическая роль церулоплазмина при лейкоцитозах и лейкопениях

Предыдущая | Следующая