Экспериментальная часть, Материалы и методы исследований - Сущность и обнаружение стафилококковых энтеротоксинов

Представленные исследования проводились в лабораторных условиях кафедры "Биотехнология" МГУПП и в ФГБУ "НИИЭМ им. Н. Ф Гамалеи "Минздравсоцразвития России в группе стафилококковых инфекций лаборатории молекулярных основ патогенности.

Материалы и методы исследований

Штаммы микроорганизмов, применявшиеся в работе

Для создания сухого твердого отрубево-овощного полуфабриката использовались дрожжи рода Pichia anomala 9a, выделенные из грудного молока кормящих женщин. В качестве молочнокислых бактерий использовалась термофильная молочнокислая культура Lactobacillus acidophilus. Культура используется в производстве пробиотических молочных продуктов (йогурты, сыры, десерты). Оптимальная температура роста для La5 - 37-400С. Может расти в пределах 28-430С. Благодаря незначительному кислотообразованию практически не оказывает никакого влияния на время сквашивания при температуре 37-430С.

В работе использовались штаммы Staphylococcus aureus FRI-722 для роста в присутствии отрубево-овощного полуфабриката и продукции энтеротоксина типа А.

Сырье, применявшееся в работе

В данной работе в качестве питательной среды для культивирования микроорганизмов в процессе создания отрубево-овощного полуфабриката применялись пшеничные отруби и свекла.

Отруби - это измельченные до определенной степени семенные оболочки и алейроновый слой с частицами эндосперма и зародышем (до 5%). Основная часть витаминов, пищевых волокон, микроэлементов и других биологически активных веществ сосредоточена в оболочках и зародыше.

Химический состав отрубей зависит не только от качества исходного сырья, но и от технологии их получения.

Оптимальное потребление пищевых волокон составляет 30-70 г/сут. По данным Организации ООН по вопросам продовольствия и сельского хозяйства фактическое потребление, как у нас, так и за рубежом едва ли достигает половины указанной величины.

Диеты с использованием отрубей, в том числе и соевых, применяются для профилактики и лечения начальной стадии желчно-каменной болезни. Отруби влияют на метаболизм желчных кислот и холестерина, удерживают воду в кишечнике, нормализуют состав микрофлоры. Добавка в пищевой рацион пищевых волокон в виде гемицеллюлозы и микрокристаллической целлюлозы способствует снижению холестерина в крови. По данным ВОЗ, его уменьшение на 10 % снизило бы смертность от сердечно-сосудистых заболеваний на 30 %.

Пищевые волокна достаточно эффективны при лечении и профилактике сахарного диабета - они уменьшают уровень глюкозы и концентрацию липопротеидов низкой плотности в крови.

В таблице _ представлен химический состав отрубей

Таблица Химический состав и содержание витаминов и минеральных веществ в отрубях

Макро - и микронутриенты

Отруби пшеничные

1

2

Общий выход. %

25±1

Белки, %

17±1

Липиды, %

4±1

Крахмал, %

10,5±2

Пищевые волокна, %

Клетчатка

10,5±2

Гемицеллюлоза

24,5±0,5

Пектин

35

Лигнин

115

Всего

48

Зольность

6±1

Витамины (мг/100г)

Тиамин (В1)

1,1±1

Рибофлавин (В2)

0,23±0,02

Пантотеновая кислота (В3)

25

Пиридоксин (В6)

1,2±0,4

Ниацин (РР)

10±0,4

Каротин (провитамин А)

33

Токоферол (Е)

27±6

Макроэлементы (мг/100г)

Na

52±6

K

1312±225

Ca

94±16

Mg

422±58

P

900

Fe

12

Микроэлементы (мг/100г)

Mn

39

Ni

0,54±0,14

Cr

0,02±0,01

Pb

0,22±0,02

Cd

0,085±0,005

Zn

79±4

Cu

1,3±0,3

Свекла столовая - одна из наиболее распространенных овощных культур. В России выращивается более ботанических 20 сортов столовой свеклы. Основными сортами являются Бордо 237, Грибовская плоская, Египетская плоская, Цилиндра.

Столовая свекла обладает многими лечебными свойствами, поэтому использование ее в питании необходимо. Корнеплоды столовой свеклы активизируют ферменты, способствует выведению токсических элементов и радионуклидов. Она содержит радиозащитные вещества. Свекла ценится за высокие вкусовые и диетические качества, целебные свойства. Богата углеводами, минеральными солями, органическими кислотами, витаминами и микроэлементами. В корнеплодах свеклы содержится 12-17% сухих веществ, (в том числе 8-12% сахаров), 1,3-2,7% белка, 20-40 мг/100 г аскорбиновой кислоты, витамины В1, В2, В6, РР, Р. В свекле содержатся уникальные вещества - бетанин и бетаин - способствующие понижению кровяного давления, улучшению жирового обмена, предупреждению атеросклероза, тормозящие развитие злокачественных опухолей. К лучшим сортам по бетанину (до 190 мг/100 г) относятся Несравненная и Подзимняя. Большое значение имеет наличие в корнеплодах свеклы полезных для организма человека кислот: яблочной, винной, лимонной, оксилимонной, молочной, а по содержанию фосфора и калия свекла занимает одно из первых мест среди овощных культур. По калорийности свекла превосходит все другие сочные овощи. Одно из ценных ее качеств состоит в том, что в отличие от других овощных растений она содержит избыток щелочей и мало кислот. Годовая норма на одного человека в России - 5,6 кг.

Методы приготовления питательных сред

Приготовление питательной среды на основе отрубево-овощного сырья для ТФФ

Для получения питательной среды для ТФФ использовались овощи и пищевые отруби, создающие хорошее разрыхление, в соотношении 1:1. Стерилизовали в паровом автоклаве при 1 атм., 121 оС, в течение 40 мин. Стерильную отрубево-овощную массу использовались как основа твердофазных сред, к которой добавляли увлажняющие компоненты.

Приготовление питательной среды типа MRS для определении молочнокислых микроорганизмов по ГОСТ 10444.11-89

60 г. сухого порошка растворить при нагревании в 1 дм3 дистиллированной воды, добавить 1 г твина 80, установить рН 6,4±2,1, разлить в колбы или флаконы и простерилизовать при температуре 121 ?С в течение 15 мин. Для селективности среды добавить к 1 дм3 агаризованной среды (после стерилизации) 1 см3 спиртового раствора сорбиновой кислоты.

Приготовление питательной среды Bifidum

50,05 г препарата тщательно размешивают в 1 л воды дистиллированной, кипятят в течение 1 мин, периодически перемешивая, до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 9,0 мл в пробирки и стерилизуют автоклавированием при температуре 112 °С в течение 30 мин.

Приготовление питательной среды Baird-Parker для определения стафилококков

20 г сухой среды Baird-Parker растворить в 300 мл дистилированной воды. Стерилизовать в автоклаве в течение 15 минут при 120 °С параллельно с 30 мл физ раствора. В охлажденном физ. растворе суспензировать один яичный желток и добавить 1,5 мл теллурита калия. Охладить ВР до температуры 50°С и влить яичную суспензию, тщательно перемешать, не вспенивая.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЖИДКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СТАФИЛОКОККОВ.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА СТАФИЛОКОККОВ НА СРЕДЕ С Baird-Parker

ОПРЕДЕЛЕНИЕ рН проводили на рН метре Mettler Toledo/

Методы обработки питательных сред перед засевом

Стерилизацию жидких питательных сред, если не оговорено особо, проводили в паровом автоклаве при 1 атм. в течение 40 мин. Стерилизацию больших объемов жидких питательных сред в производственных условиях осуществляли в установке непрерывной стерилизации.

Метод посева на плотные среды в чашки Петри

Посев в чашки Петри проводится поверхностным способом для этого плотную стерильную питательную среду расплавляют на кипящей водяной бане и, соблюдая правила стерильности, разливают ровным слоем толщиной 3-5 мм в стерильные чашки Петри. Оставляют до полного застывания среды. На поверхность среды вносят инокулят и петлей в виде параллельных или зигзагообразных штрихов.

Метод поддержания чистых культур

Для поддержания в активном состоянии чистых культур в лабораторной практике пользуются методами посева и пересева с соблюдением асептики. Посев - внесение инокулята (части исследуемого материала) в стерильную питательную среду, пересев - перенос части выращенной на питательной среде культуры микроорганизма на другую, свежую стерильную среду. Посев (пересев) микроорганизмов проводят при соблюдении правил стерильности, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами и не загрязнять окружающую исследуемыми культурами микроорганизмов.

Пересев микроорганизмов, выращенных на твердой среде

Посев микробиогической петлей на скошенную агаризованную среду производят: зигзагообразным штрихом, начиная со дна косяка, где есть конденсационная вода, скользя петлей по поверхности плотной среды от одного края пробирки к другому; прямой чертой, для чего проводят кольцом петли прямую линию снизу вверх посередине поверхности питательной среды; сплошным посевом, распределяя материал круговыми движениями по всей поверхности среды.

При посеве и пересеве необходимо соблюдать следующие приемы:

В левую руку берут две пробирки - одну со стерильной средой, другую с культурой и держат в наклонном положении. В правой руке большим и указательным пальцем держат бактериальную петлю и стерилизуют в пламени горелки.

Вынимают ватные пробки из обеих пробирок, прижимают к ладони мизинцем и безымянным пальцами правой руки и обжигают края пробирок. Следят за тем, чтобы пробки не касались посторонних предметов.

    3. Петлю вводят в пробирку с пересеваемой микробной культурой. Для охлаждения петли следует прикоснуться к поверхности агара или внутренней стенки пробирки, где нет культуры, после чего берут небольшое количество микробной массы с плотной среды на кольцо петли. 4. Вводят петлю с клетками микроорганизмов в пробирку почти до дна, где скапливается небольшое количество конденсационной воды. Слегка касаясь кольцом петли поверхности плотной среды, но, не разрыхляя ее, проводят от дна вверх штрих. 5. Петлю вынимают, обжигают края пробирок и внутренние концы пробирок, после чего пробирки закрывают. 6. Петлю вновь прокаливают в пламени горелки и ставят в штатив или стакан вверх кольцом петли. 7. На пробирке делают надпись: название культуры и дату посева.

Метод получения посевного материала

Чистые культуры дрожжей хранились в пробирках со скошенным морковным агаром в холодильнике при температуре 4єС. Смыв с них использовался как посевной материал при засеве небольших объемов жидких питательных сред.

Методы культивирования микроорганизмов

Твердофазное культивирование на косяках и чашках Петри ведут в термостате в течение 2 суток, при температуре 28-30 єС.

Культивирование стафилококков ведут в жидкой среде Bifidum в течение суток при 37 єС. СРЕДА CASMAN в модификации ФЛУЕРА Ф. С.

Метод определения концентрации дрожжевых клеток

Число клеток в единице объема определяют непосредственным подсчетом в счетных камерах. При этом учитываются живые и мертвые клетки. Методы высева позволяют учесть только живые клетки. Счетная камepa Горяева представляет собой предметное стекло, разделенное бороздками. На центральной части стекла нанесена сетка. Площадь большого квадрата сетки в камере Горяева соответствует 1/25 мм2, площадь малого квадрата равна 1/400 ммІ, глубина камеры 0,1 ммІ.

Подсчет числа клеток проводят с объективом 8Х или 40Х. Подсчет клеток производят в 5 больших или 80 малых квадратах сетки. Количество клеток в 1 мл исходной суспензии рассчитывается по формуле:

Н х S

Т - число клеток в 1 мл суспензии;

А - среднее число клеток в квадрате сетки;

Н - глубина камеры в мм;

S - площадь квадрата сетки в мм;

В - разведение исходной суспензии.

Метод определения молочнокислых микроорганизмов

Определение молочнокислых микроорганизмов проводят по ГОСТ 10444.11-89.

Готовили разведения, для чего 1 см3 образца последовательно переносили в ряд пробирок с 9 см3 физиологического раствора.

Посев в жидкую питательную среду (натуральное или восстановленное обезжиренное молоко, предварительно простерилизованное в течение 10 мин при t = 121 ?С) осуществляли из трех-четырех последних разведений в двух повторностях.

Пробирки с посевами помещали в термостат и инкубировали при температуре 38 ?С в течение 2-4 дней.

Для подсчета общего количества молочнокислых бактерий отмечают три последних разведения, в которых молоко свернулось. Составляют числовую характеристику. Она состоит из трех цифр, указывающих число пробирок со свернувшимся молоком в трех последних разведениях. По таблице находят наиболее вероятное число молочнокислых микроорганизмов, которое умножают на то разведение, с которого начинается первая цифра числовой характеристики. Полученное число соответствует количеству клеток молочнокислых бактерий в 1 г или 1 см3 продукта.

Посев на плотные среды производили из разных разведений. Засеянные чашки Петри помещали в термостат. Сроки учета микроорганизмов зависели от состава питательной среды и группы учитываемых микроорганизмов.

На ГРМ на 2-3 сутки инкубации учитывали споровые и неспоровые формы бактерий (общая обсемененность). На среде YGC на 2-3 сутки учитывали колонии дрожжей.

Посев на плотную среду. Каждое разведение высевают в чашки Петри глубинным способом, то есть по 1 см3 каждого разведения переносят стерильной пипеткой в стерильные чашки Петри и заливают ровным слоем толщиной 3-5 мм стерильной теплой питательной среды. Оставляют до полного застывания среды. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат с температурой 37 °С, благоприятной для инкубирования бактерий и температурой 30 °С, благоприятной для инкубирования дрожжей.

Подсчет колоний. Колонии учитывают через 2-3 суток выращивания. Для счета берут те чашки Петри, на которых колонии хорошо отделены одна от другой. Каждую отсчитанную колонию помечают точкой с нижней стороны чашки Петри маркером. При большом количестве колоний дно чашки делят на секторы, подсчитывают количество колоний в каждом секторе и результаты суммируют.

Зная количество выросших колоний и степень разбавления, определяют количество бактерий в 1 г объекта, пользуясь формулой:

N = (n*К) / V,

Где N - количество бактерий в 1 г объекта;

К - разведение, из которого проведен высев;

N - среднее количество колоний на чашке Петри при разведении;

V - объем суспензии, взятый для посева, см3.

Иммуноферментный анализ.

Принцип иммуноферментного анализа основан на использовании антител, осуществляющих специфическое связывание определенного антигена. В качестве метки, которой маркируют антиген или антитело, служит фермент, количество которого определяют в энзиматической реакции по концентрации субстрата или продукта его расщепления. В случае простого сэндвич - метода ИФА, исследуемый антиген реагирует с антителами, иммобилизованными на твердой фазе. После промывки в систему добавляют антитела, меченные ферментом, и после инкубации и удаления не прореагировавших компонентов измеряют ферментативную активность, добавляя к системе субстрат, подходящий для конъюгированного фермента. Для получения количественной информации система предварительно калибруется по стандартному препарату определяемого антигена. В качестве твердофазного носителя часто используют пластмассовые планшеты.

Порядок действий с планшетом при ИФА

Полистероловый планшет.

Взаимодействие антител с полистиролом

В течение 2 часов при 370С или 18 - 20 часов при 4оС.

Планшет с антителами

Отмывка от не прореагировавших антител

4 раза каждые 5 минут PBS-раствором с Tween-20, рН 7,2 - 7,4, при комнатной температур

Планшет с антителами

Взаимодействие антител с антигеном

1 час при 370С

Планшет с антителами и антигеном

Отмывка от не прореагировавшего антигена

5 раз каждые 5 минут PBS-раствором с Tween-20

Планшет с комплексом: антител - антигена

Взаимодействие антигена с конъюгатом

1 час при 370С

Планшет с комплексом антител - антигена - конъюгата:

Отмывка от не прореагировавшего конъюгата

6 раз каждые 5 минут PBS-раствором с Tween-20

Планшеты с комплексом антител - антигена - конъюгата

Взаимодействие пероксидазы конъюгата с субстратом

При комнатной темепературе в течение 1 часа, изменение окраски индикатора продуктом реакции пероксидазы и Н202

Планшеты отмывали в ФСБР (PBS) с 0,05%-ым Tween-20. Разведение исследуемого материала делали в ФСБР (рН = 7,2) с добавлением 0,05%-ного Tween-20. Реакцию взаимодействия токсин-содержащих проб с иммобилизованными антителами и конъюгатом проводили при 370С в течение 1 ч. В качестве хромогенного субстрата использовали 0,04%-ный ортофенилендиамин (ОФД) в 0,1 М цитратно - фосфатном буфере (рН = 5,0) с 0,04 %-ной перекисью водорода. Субстрат добавляли по 100 мкл. Реакцию останавливали равными объемами 1,5 н раствора серной кислоты. Результаты учитывали инструментально, измеряя оптическую плотность продуктов реакции на фотометре "Multiscan" (Англия), при длине волны 492 нм по соотношению оптических плотностей опытных и контрольных образцов (ОПо/ОПк). Положительными считают пробы, соотношение ОПо/ОПк для которых было больше 2.

Подготовка ингредиентов к проведению анализа:

1.Приготовление растворов.

Раствор №1. Карбонатно - бикарбонатный буферный раствор с концентрацией 0,05 моль/дм3 (рН = 9,5 + 0,1). Раствор буфера можно хранить в течение месяца при температуре (4 ± 20С).

Раствор №2. Фосфатно - солевой буферный раствор с концентрацией 0,1 моль/дм3 (рН = 7,2 + 0,2). Раствор можно хранить в течение месяца при температуре (4+20С).

Раствор №2А. Раствор для разведения исследуемого материала и отмывания планшетов готовят из раствора №2. К 1 дм3 раствора №2 добавляют 0,5 см3 детергента (Tween-20). Раствор №2А хранению не подлежит.

Раствор №2Б. Содержимое флакона с этикеткой "БСА" растворяют в 50 см3 раствора №2А и получают раствор для разведения конъюгата. Хранению не подлежит.

Раствор №3. Цитратно - фосфатный буферный раствор с концентрацией 0,1 моль/дм3 (рН = 5,5 + 0,2) - субстратный буферный раствор. В 25 см3 дистиллированной воды растворяют 0,32 г лимонной кислоты, в 25 см3 дистиллированной воды растворяют 1,65 г Na2HPO4*12H2O. Хранят оба раствора по отдельности в течение не более 2-х недель при t=60С. Перед использованием растворы смешивают в соотношении 1:1 и добавляют 4 - 5мг ОФД.

Раствор №4. 4 - 5 мг ОФД растворяют в 10 см3 раствора №3. Раствор №4 готовят за 10 минут до использования, хранят в темном месте при комнатной температуре.

Раствор №5. Одну таблетку гидроперита растворяют в 10 см3 дистиллированной воды. Полученный 30%-ный раствор перекиси водорода хранят в темной посуде при температуре 4 - 60С. Срок хранения 1 месяц.

Раствор №6. Субстратный буфер готовят непосредственно перед внесением в лунки планшета. Смешивают 10 см3 раствора №4 и 0,17 см3 раствора №5 в соотношении 1:10 (получаем 3%-ный раствор перекиси водорода). Субстратный буфер хранению не подлежит.

Раствор №7. Раствор серной кислоты в концентрации 1,5 моль/дм3. 1,5 см3 концентрированной серной кислоты растворяют в 15 см3 дистиллированной воды. Хранят при температуре (18 + 20С).

2. Раститровка для проведения иммуноферментного анализа.

Условия проведения иммуноферментного анализа для обнаружения стафилококкового энтеротоксина А (рабочее разведение конъюгата, оптимальную концентрацию иммуноглобулинов на планшет для сенсибилизации, специфическую чувствительность тест - системы) определяют с помощью метода шахматного титрования с тремя переменными.

Для сенсибилизации одного планшета требуется 24 см3 IgG (96 лунок, по 0,25 см3 в каждую). Анализ подразумевает выбор оптимальной концентрации IgG для сенсибилизации, т. е. для концентрации 10 мкг/см3 или 10г в 0,026 см3 IgG с концентрацией белка 9000г добавляют 23,974 см3 карбонатно - бикарбонатного буферного раствора с концентрацией 0,05 моль/дм3 (рН = 9,5).

Ход определения:

    1. В лунки вертикальных рядов планшета с 1 - 12 вносят с помощью дозатора пипеточного по 250 мкл раствора иммуноглобулинов в концентрации 10 мкг/см3. Сорбцию на планшеты иммуноглобулинов проводят в течение 2 часов при температуре (37 ± 20С) или 18 часов при температуре (4 ± 20С). 2. По окончанию сорбции, не связавшиеся иммуноглобулины удаляют из лунок планшета сильным встряхиванием перевернутого планшета, и отмывают 4 раза по 5 минут раствором № 2А (промывной раствор вносят до краев лунок), встряхивают и высушивают фильтровальной бумагой. 3. В лунки вносят различные разведения проб в соответствии с картой раститровки. В последние 2 лунки 9-12 вертикальных рядов вносят отрицательный контроль. 4. Планшеты выдерживают в термостате при температуре (37 ± 20С) в течение 1 часа, затем жидкость из лунок удаляют встряхиванием в посуду с 5 %-ным раствором перекиси водорода и отмывают 5 раз. 5. В лунки вносят конъюгат по 0,1 см3. 6. Планшеты выдерживают в термостате при температуре (37 ± 20С) в течение 1 часа. 7. Удаляют жидкость из лунок планшета резким встряхиванием и отмывают 6 раз. 8. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл раствора №6. Планшет выдерживают в темноте при температуре (20 ± 20С) от 5 до 30 минут до появления слабо - желтой окраски в контрольных лунках. 9. Реакцию останавливают внесением в лунки по 100 мкл раствора №7 (раствор серной кислоты). 10. В лунках, где прошла реакция, появляется окрашивание от светло - желтого до оранжево - коричневого. В лунках, где исследуемые пробы не содержат специфического антигена, субстрат бесцветный или слабо окрашенный. 11. При проведении ИФА необходимы следующие виды контроля:
      А) контроль конъюгата: постановку реакции проводят в описанной последовательности, но вместо раствора, содержащего специфический антиген, вносят раствор № 2А. Должен быть отрицательный результат. Б) контроль чувствительности тест - системы: постановку реакции проводят в описанной последовательности со специфическим антигеном в рабочем разведении.

Иммуноферментная тест - система была нами использована для определения влияния различных пектинов на продукцию SEA и для определения SEA у штаммов стафилококков, выделенных из различных источников (при атопическом дерматите и дисбактериозе кишечника).

В качестве модельной системы, для изучения влияния отрубево-овобщного полуфабриката на продукцию SEA, был взят штамм, продуцирующий SEA (S. aureus FRI-722). Выращивание данного штамма стафилококка проводят в пробирках объемом 50 см3, в которые вносят по 4,5 см3 питательной среды на основе ферментативного казеинового гидролизата. Затем в пробирки со средой вносят суточную культуру стафилококка в объеме 0,5 см3 и отрубево-овощной полуфабрикат из расчета конечной концентрации в среде - 10%.

Контролем служит тот же штамм стафилококка, выращенный на аналогичной питательной среде, но без добавления отрубево-овощного полуфабриката. Выращивание бактериальной культуры, как в контроле, так и в опыте проводят на шуттель - аппарате при 210 об/мин, в течение 24 часов при 37°С. Далее берут 0,5 см3 жидкой культуры стафилококков и вносят в пробирку с 4,5 см3 физ. раствора, и делают 10 - кратные разведения (от 10-1 до 10-12). В контроле проводят разведение и учет количества микробных клеток таким же образом, как и в опыте. Из разведений берут по 50 мкл раствора культуры, раскапывают по три капли на чашки Петри с плотной питательной средой Baird - Parker, содержащей теллурит калия, и распределяют равномерным слоем при помощи шпателя. Теллурит калия придает черный цвет выросшим колониям, что облегчает их подсчет.

Для определения SEA после окончания культивирования в жидкой питательной среде микробные клетки подвергают термальной обработке в течение 15 минут при 1000С и удаляют центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 мин. Содержание токсина определяют в надосадочной жидкости с помощью ИФА.

Похожие статьи




Экспериментальная часть, Материалы и методы исследований - Сущность и обнаружение стафилококковых энтеротоксинов

Предыдущая | Следующая