Обнаружение стафилококковых энтеротоксинов - Сущность и обнаружение стафилококковых энтеротоксинов

Проблема большинства бактериальных энтеротоксинов до настоящего времени изучена недостаточно и является весьма актуальной. Имеется большие потребности в разработке доступных высокоэффективных отечественных питательных сред для получения бактериальных энтеротоксинов, унифицированных методов выделения, обнаружения и разработки диагностических препарато для их индикации.

Существуют разнообразные методы обнаружения энтеротоксинов, однако некоторые из них обладают малой чувствительностью, а для использования более чувствительных методов, например иммунологических, необходимо получение диагностических препаратов. Все серологические методы, применяемые для индикации энтеротоксинов, требуют специфической антисыворотки, от качества которой зависит и результативность того или иного метода. В свою очередь высокоспецифичную сыворотку, возможно, получить после иммунизации животных гомогенными препаратами энтеротоксинов. [36,40]

До последнего времени для индикации стафилококковых энтеротоксинов были доступны лишь биологические методы. Однако по мере получения гомогенных препаратов СЭ появилась возможность обнаруживать их иммуносерологическим путем, используя для этих целей специфические антиэнтеротоксические сыворотки. В свою очердь высоко специфичную сыворотку возможно получить после иммунизации животных гомогенными препаратами энтеротоксинов.

В России было проделано большое количество научно-исследовательских работ по обнаружению стафилококковых энтеротоксинов А, В, С и Д. Наиболее значимые для науки работы были проведены в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН под руководством Флуера Ф. С.: Впервые была предложена унифицированная основа питательной среды для получения бактериальных токсинов, питательная среда для обнаружения СЭА и СЭВ, предложена технология промышленного получения стафилококковых энтеротоксических сывороток типов А и В, разработана производственная технология изготовления иммуноферментной тест-системы для определения СЭА и СЭВ с чувствительностью 2 нг/мл, разработан методологический подход для подготовки культур энтеробактерий для определения энтеротоксина.

Необходимо подчеркнуть, что предложенные диагностические препараты и тесты для определения энтеротоксинов характеризуются доступностью, чувствительностью и быстротой получения результатов., являются высоко специфичными. Они пригодны для индикации СЭ TSST-1, ТЛ энтеротоксина кишечной палочки, энтеротоксина сальмонелл, термолабильного энтеротоксина клебсиелл и энтеробактер., энтеротоксина Bacillus cereus.

Разработанные препараты дают возможность развития нового направления бактериальных энтеротоксинов их изучения и индикации. Они используются как в Российской Федерации так и ближнее зарубежье, поскольку часть из них уже являются коммерческими препаратами.

Следует подчеркнуть, что в настоящее время биологические методы стали усиленно вытесняются серологическими методами.

В настоящее время для индикации СЭ кроме теста кормления обезьян, кошек, котят используют еще тест кормления поросят. Однако, биологические методы индикации энтеротоксинов уступают место серологическим, которые гораздо проще, чувствительнее и дешевле.[38] Недостатком биологических методов является их относительная специфичность и невоспроизводимость. Они непригодны для использования в широкой лабораторной и клинической практике, кроме того, животные менее чувствительны к действию SE, так как позволяют определять только более чем 200 нг SE и поэтому биологические методы индикации энтеротоксинов уступают место серологическим, которые гораздо проще, чувствительнее и дешевле. Для выявления содержания энтеротоксинов в пищевых продуктах, животным (в данном случае кошкам) вводят экстракты из пищевых продуктов в вену, ухо или бедренную вену в количестве 0,5 см3 на килограмм веса тела. Энтеротоксины вызывают рвоту через 30 минут - 5 часов. Рвоту и понос считают положительной реакцией, общее недомогание (вялость, отказ от пищи) - сомнительной, отсутствие - отрицательной реакцией. Каждое животное можно использовать 3 - 4 раза.[6, 33]

Для индикации СЭ используются такие методы как метод простой и двойной гельдиффузии, радиальная иммунодиффузия, встречный иммуноэлектрофорез, электроиммунодиффузия, методы агглютинации, такие как метод ингибирования пассивной гемагглютинации, метод агрегат гемагглютинации, метод непрямой пассивной гемагглютинации, метод латексагглютинации, метод коагглютинации, радиоиммунологические методы, методы иммуноферментного анализа. Расссмотрим эти методы подробнее.[37]

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации применяется в лабораторной практике для идентификации выделенных микроорганизмов или для обнаружения специфических антител в сыворотке крови. Механизм реакции основан на взаимодействии детерминантных групп антигена с активными центрами иммуноглобулина в электролитной среде. Реакции протекают в две фазы - соединение антигена с антителом, вторая фаза - выделение в осадок образовавшегося комплекса АГ+АТ. Характер осадка зависит от природы антигена: жгутиковые бактерии дают крупнохлопьевый осадок, безжгутиковые и бескапсулярные - мелкозернистый, капсульные - тяжистый. Существуют два способа постановки реакции агглютинации: пластинчатый и пробирочный. Пластинчатый метод является качественной реакцией и служит для предварительного определения вида микроба. Пробирочный метод используется для определения количественного содержания антител, при этом в пробирках ставится развернутая реакция агглютинации. При положительной реакции на дне пробирки образуется осадок ( агглютинат ). За титр антител принимают последнее разведение, в котором наблюдается четкая агглютинация. Интенсивность оценивается по 4-х крестной системе. Постановка РА должна сопровождаться контролем сыворотки и антигена. Учет реакции агглютинации на стекле производится через 5 - 10 мин, пробирочной - через 18 - 20 часов.[13]

Реактция преципитации

Феномен преципитации заключается во взаимодействии мелкодисперсных антигенов (преципитиногенов) с соответствующими антителами (преципитинами) и образованием преципитата (рис. 1). Постановку РП осуществляют двумя методами: в жидкой среде - по типу реакции флокуляции, кольцепреципитации или в плотной среде в агаре (геле). РП применяют в двух целях: выявление антигенов по известной иммунной преципитирующей сыворотке или антител с использованием известных антигенов. Существует много вариантов постановок реакции, но чаще всего используют следующие методики: реакция преципитации в геле по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия по Манчини, реакция иммуноэлектрофореза, реакция флокуляции, кольцепреципитации.

Рис. 1. Реакция преципитации:1 - антиген; 2 - антитело.

Реакция преципитации в геле по Оухтерлони. Для постановки реакции используют 1% агар Дифко, который разливают расплавленным на предметные стекла или чашки Петри слоем толщиной 0,5 см. В застывшем агаре вырезают лунки диаметром 5 мм специальным приспособлением. В одну лунку помещают взвесь, содержащую исследуемый антиген, в другую - иммунную сыворотку. Антиген и антитела диффундируют в питательную среду, вступают в иммунную реакцию и образуют полосы преципитации. Учет реакции проводят предварительно через 4 часа, окончательно - через 24-48 часов. Реакцию Оухтерлони можно использовать для определения токсичности бактерий, титра антител, активности стандартных диагностикумов или иммунных специфических сывороток (рис. 2).

Рис. 2. Реакция преципитации: А - реакция кольцепреципитации ; Б - реакция преципитации по Оухтерлони.

Реакция кольцепреципитации

Данную реакцию применяют для выявления антигенов с помощью иммунной преципитирующей сыворотки, содержащей специфические антитела. Это качественный метод исследования. Реакцию проводят путем наслаивания на иммунную сыворотку среды, содержащей определенный антиген. Реакцию ставят в узких пробирках объемом 0,1- 0,5 мл. В случае соответствия антигена и антитела на границе между ними через 3-5 мин образуется кольцо преципитации (рис. 2). Необходимым условием образования нерастворимого иммунного комплекса является эквивалентное соотношение антигенов и антител. [41]

Радиальная иммунодиффузия по Манчини

Радиальная иммунодиффузия по Манчини позволяет использовать моноспецифические антисыворотки и эталон с известным содержанием антигена. Тест-антиген и разведения растворов, исследуемых на наличие данного антигена, помещают в лунки, вырезанные рядами в пластине геля, куда предварительно внесена соответствующая моноспецифическая антисыворотка.

Антиген диффундирует в гель и, соединившись со специфическими антителами, формирует кольца преципитации, диаметры которых зависят от концентрации антигена в лунках. Полученные результаты используют для построения калибровочной кривой, выражающей зависимость диаметров преципитантов от концентрации антигена в исследуемых растворах (рис. 3). Принцип радиальной диффузии положен в основу метода, применяемого для изучения токсигенности бактериальных культур и отбора из бактериальной популяции клонов с высокой степенью токсичности. В этом случае исследуемые культуры засевают в чашки с агаром, содержащим антитоксическую сыворотку. Вокруг отдельных колоний образуются кольца преципитации, диаметр которых прямо пропорционален степени токсичности штамма (рис. 3). [42]

Рис. 3. Простая радиальная иммунодиффузия: а - кольца преципитации;б - калибровочная кривая.

Реакция непрямой гемагглютинации

РНГА применяют в двух вариантах: с известными антигеном для обнаружения антител или с известными антителами для выявления антигена. Эта реакция специфична и применяют ее для диагностики заболеваний вызванных бактериями и риккетсиями. Для постановки РНГА используют эритроцитарные диагностикумы, приготовленные путем адсорбции на эритроцитах антигенов или антител в зависимости от цели исследования (рис. 6). В положительных случаях степень агглютинации эритроцитов отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имеющую вид тонкой пленки из склеивающихся эритроцитов (зонтик), покрывающей дно пробирки, наличие пленки с фестончатыми кружевными краями обозначают двумя плюсами. За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызывавшее агглютинацию эритроцитов на два полюса. [37,38]

Рис. 6. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации:

1 - эритроциты;2 - антигенэритроцита ;3 - конъюгированный антиген;4 - антитело.

Метод иммуноферментного анализа

Метод используется для выявления антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой ( пероксидазой хрена, b - галактозой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат и хромоген.

Субстрат расщепляется ферментом, а его продукты деградации вызывают химическую модификацию хромогена. При этом хромоген меняет свой цвет - интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител (рис. 9).

Рис. 9. Иммуноферментный анализ, выявление антигена прямым и непрямым методами твердофазного ИФА.

Наиболее распространен твердофазный ИФА, при котором один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе. В качестве твердого носителя используются микропанели из полистирола. При определении антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больных, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителом. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а за тем - смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. ИФА применяют для диагностики заболеваний, вызванных вирусными и бактериальными возбудителями. [24,38,40]

Метод микрочипов.

Метод микрочипов позволяет проводить одновременный тест на наличие нескольких токсинов в образце, в отличии от традиционных иммунологических методов. Биологические микрочипы, позволяют обнаружить присутствие нескольких соединений (до 120) в анализируемом образце. Для прямого иммуноанализа меченных флуоресцеином энтеротоксинов фирмой Nаоgеn предложены электронные микрочипы с иммобилизованными антителами. Иммобилизация биотинилированых антител на микрочипе осуществлялась путем образования комплексов авидин - биотин на микросайтах, содержащих авидин. Приготовление биологических микрочипов осуществляется следующим образом:

А) упорядоченный массив трехмерных гидрогелевых ячеек на твердой подложке, содержащих иммобилизованные антитела к различным токсинам или токсины, причем в каждой отдельной ячейке иммобилизовано антитело к индивидуальному токсину или индивидуальный токсин; Б) инкубация микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу токсины, для образования иммунных комплексов биотоксин - антитело, которую при необходимости проводят в условиях перемешивания; В) определение образовавшегося комплекса; Г) количественное обнаружение анализируемого токсина.

При нанесении на микрочип реакционной среды, содержащей анализируемый образец (биотоксин), происходит образование иммунных комплексов со специфическими лигандами, иммобилизованными в гелевых ячейках микрочипа. Детекцию образовавшегося комплекса и последующее количественное обнаружение проводят в формате прямого, конкурентного или сэндвич - иммуноанализа. К недостаткам описанных в литературе способов анализа токсинов на микрочипах относятся сложная технология изготовления микрочипов: объединение нескольких блоков, подведение каналов для подачи растворов, присоединение электродов. Регистрация сигналов производится с использованием сложной и дорогостоящей аппаратуры: конфокальный микроскоп, Рамановская спектроскопия и др., поэтому микрочипы не применяются на практике из - за необходимости использования дорогостоящего оборудования.[37, 38, 50]

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг (иногда называемый вестернблоттингом от английского western - западный) - это метод исследования белковых антигенов. Его используют чтобы методы, используемые для определения SE в пищевых продуктах, имели как можно меньший процент как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов. Этого можно избежать при наличии эндогенных пероксидаз в образцах пищи. Метод заключается в том, что смесь известных антигенов перед определением энтеротоксинов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану с последующим добавлением меченых антител к известным антигенам. Это высокоспецифичный и высокочувствительный метод, подтверждающий результаты, полученные при помощи РПГА или ИФА. Уникальность иммуноблота заключается в его высокой информативности и достоверности получаемых результатов.[60]

Таким образом, из всех методов, используемых с целью определения стафилококковых энтеротоксинов, наиболее чувствительными являются методы радиоиммунологического анализа и обратной пассивной гемагглютинации, наиболее доступными - метод двойной диффузии в геле и ИФА.

Обнаружение стафилококковых энтеротоксинов - Сущность и обнаружение стафилококковых энтеротоксинов

Похожие статьи