Объект и методы исследования, Объект исследования, Схема экспериментов, Схема экспериментов in vitro - Антигипоксическое и нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии in vivo и in vintro

Объект исследования

Объектом исследований In vitro Служили первичные диссоциированные культуры клеток гиппокампа, полученные от 18-дневных мышиных эмбрионов линии CBA (вид Mus musculus). Всего в экспериментах была использована 361 культура.

В опытах In vivo Использовано 116 4-х недельных самцов мышей линии C57BL/6. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, указанным в Приказе Минздрава России № 708н от 23.08.10 "Об утверждении Правил лабораторной практики" и были согласованы с этическим комитетом при ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России.

Схема экспериментов
Схема экспериментов in vitro

Распределение экспериментальных групп представлено в табл.1. Культуры подвергали гипоксии на 21-й день In vitro (DIV). В интактной группе культур осуществлялась смена нормоксической культуральной среды. В культурах контрольной группы нормоксическую среду на 10 минут заменяли на гипоксическую, затем клетки возвращали нормоксическую среду, т. е. подвергали реоксигенации. В культуры других групп во время гипоксии, при реоксигенации и в течение суток после нее добавляли N-ADA 2,5 и 10 мкМ (синтезирован в лаборатории оксилипинов ИБХ РАН) и N-ADA в комбинации с антагонистом CBR-1, SR141716A (Sanofi), 1 мкМ, антагонистом CBR-2, SR144528 (Sanofi), 1 мкМ и антагонистом TRPV1, капсазепином (Tocris), 1 мкМ.

Таблица 1

Распределение экспериментальных групп in vitro

Серия

Название группы

DIV

Количество культур

Влияние N-ADA на

Спонтанную биоэлектрическую активность диссоциированных культур гиппокампа при гипоксии

Интактные

21-28

5

Контрольные (гипоксия без

N-ADA)

5

N-ADA 2,5 мкМ

5

N-ADA 10 мкМ

5

N-ADA 10 мкМ +

SR141716A 1 мкМ

5

N-ADA 10 мкМ + SR144528

1 мкМ

5

N-ADA 10 мкМ +

Капсазепин 1 мкМ

5

Влияние N-ADA на

Спонтанную кальциевую активность клеток диссоциированных культур гиппокампа при гипоксии

Интактные

21, 28

15

Контроль (гипоксия без N-

ADA)

15

N-ADA 2,5 мкМ

10

N-ADA 6 мкМ

10

N-ADA 10 мкМ

15

Влияние N-ADA на

Выживаемость нервных клеток в диссоциированных культурах гиппокампа при гипоксии

Интактные
    21, 22, 24, 28, 31

40

Контроль (гипоксия без N-

ADA)

40

N-ADA 10 мкМ

40

N-ADA 10 мкМ +

SR141716A 1 мкМ

40

N-ADA 10 мкМ + SR144528

1 мкМ

40

N-ADA 10 мкМ +

Капсазепин 1 мкМ

40

Влияние N-ADA на

Экспрессию CBR при гипоксии

Интактные

28

21

Контрольные (гипоксия без

N-ADA)

N-ADA 10 мкМ

Активность нейронной сети, регистрировали непосредственно до гипоксии, во время нее, после реоксигенации, через 2 часа и через каждые 24 часа в течение 7 дней после гипоксии.

Спонтанную кальциевую активность регистрировали при гипоксии и на 7 сутки постгипоксического периода. Оценка жизнеспособности культур осуществляли до гипоксии, на 1, 3, 7 и 10 сутки постгипоксического периода. Иммуноцитохимические исследования проводили на 7 сутки после гипоксии.

Похожие статьи




Объект и методы исследования, Объект исследования, Схема экспериментов, Схема экспериментов in vitro - Антигипоксическое и нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии in vivo и in vintro

Предыдущая | Следующая