Структура и химия хроматина

Хроматин - это сложная смесь веществ, из которых построены хромосомы эукариот. Основными компонентами хроматина являются ДНК и хромосомных белков, в состав которых входят гистоны и негистоновые белки, образующие высокоупорядоченные в пространстве структуры. Соотношение ДНК и белка в хроматине составляет ~1:1, а основная масса белка хроматина представлена гистонами. Термин "Х" введен У. Флеммингом в 1880 г. для описания окрашиваемых специальными красителями внутриядерных структур.

Хроматин - основной компонент клеточного ядра; его достаточно легко получить из выделенных интерфазных ядер и из выделенных митотических хромосом. Для этого используют его свойство переходить в растворенное состояние при экстракции водными растворами с низкой ионной силой или просто деионизованной водой.

Фракции хроматина, полученные из разных объектов, обладают довольно однообразным набором компонентов. Было найдено, что по суммарному химическому составу хроматин из интерфазных ядер мало отличается от хроматина из митотических хромосом. Главными компонентами хроматина являются ДНК и белки, среди которых основную массу составляют гистоны и негистоновые белки.

Слайд 3. Различают две разновидности хроматина: гетерохроматин и эухроматин. Первый отвечает конденсированным во время интерфазы участкам хромосом, он является функционально неактивным. Этот хроматин хорошо окрашивается, именно его можно видеть на гистологическом препарате. Гетерохроматин делится на структурный (это участки хромосом, которые постоянно конденсированные) и факультативный (может деконденсуватись и переходить в эухроматин). Эухроматин соответствует деконденсованим в интерфазе участкам хромосом. Это рабочий, функционально активный хроматин. Он не окрашивается, его не видно на гистологическом препарате. Во время митоза весь эухроматин конденсируется и включается в состав хромосом.

В среднем в хроматине около 40% приходится на ДНК и около 60% - на белки, среди которых специфические ядерные белки-гистоны составляют от 40 до 80% от всех белков, входящих в состав выделенного хроматина. Кроме того, в состав хроматиновой фракциям входят мембранные компоненты, РНК, углеводы, липиды, гликопротеиды. Вопрос о том, насколько эти минорные компоненты входят в структуру хроматина, еще не решен. Так, РНК может представлять собой транскрибируемую РНК, которая еще не потеряла связь с матрицей ДНК. Другие же минорные компоненты могут относиться к веществам соосажденных фрагментов ядерной оболочки.

БЕЛКИ - класс биологических полимеров, присутствующих в каждом живом организме. С участием белков проходят основные процессы, обеспечивающие жизнедеятельность организма: дыхание, пищеварение, мышечное сокращение, передача нервных импульсов.

Белки являются полимерами, а аминокислоты - их мономерные звенья.

Аминокислоты - это органические соединения, содержащие в своем составе (в соответствии с названием) аминогруппу NH2 и органическую кислотную, т. е. карбоксильную, группу СООН.

Белковая молекула образуется в результате последовательного соединения аминокислот, при этом карбоксильная группа одной кислоты взаимодействует с аминогруппой соседней молекулы, в результате образуется пептидная связь - CO-NH - и выделяется молекула воды. Слайд 9

Белковые молекулы содержат от 50 до 1500 аминокислотных остатков. Индивидуальность белка определяется набором аминокислот, из которых составлена полимерная цепь и, что не менее важно, порядком их чередования вдоль цепи. Например, молекула инсулина состоит из 51 аминокислотного остатка.

Химический состав гистонов. Особенности физических свойств и взаимодействие с ДНК

Гистоны - относительно небольшие белки с очень большой долей положительно заряженных аминокислот (лизина и аргинина); положительный заряд помогает гистонам крепко связываться с ДНК (которая заряжена сильно отрицательно) независимо от ее нуклеотидной последовательности. Комплекс обоих классов белков с ядерной ДНК эукариотических клеток называется хроматином. Гистоны являются уникальной характеристикой эукариот и присутствуют в огромных количествах на клетку (около 60 миллионов молекул каждого типа на клетку). Типы гистонов распадаются на две главных группы - нуклеосомные гистоны и Н1 гистоны, образуя семейство высококонсервативных основных белков, состоящее из пяти больших классов - H1 и H2A, H2B, H3 и H4. Гистоны H1 более крупные (около 220 аминокислот) и оказались менее консервативными в ходе эволюции. Размер полипептидных цепей гистонов лежит в пределах от 220 (H1) до 102 (H4) аминокислотных остатков. Гистон H1 сильно обогащен остатками Lys, для гистонов H2A и H2B характерно умеренное содержание Lys, полипептидные цепи гистонов H3 и H4 богаты Arg. Внутри каждого класса гистонов (за исключением H4) на основании аминокислотных последовательностей различают несколько субтипов этих белков. Такая множественность особенно характерна для гистонов класса H1 млекопитающих. В этом случае различают семь субтипов, названных H1.1-H1.5, H1o и H1t. Гистоны H3 и Н4 принадлежат к наиболее консервативным белкам. Такая эволюционная консервативность предполагает, что для функции данных гистонов важны почти что все их аминокислоты. N - концевая часть данных гистонов может быть обратимо одифицирована в клетке за счет ацетилирования отдельных остатков лизина, что убирает положительный заряд лизинов.

Ядро область хвоста гистона.

Бусинки на струне Ля

Малая дальность взаимодействия

Гистоны компоновщика

Волокно на 30 нм

Волокно хромонемы

Взаимодействия волокна волокна дальнего действия

Нуклеосома хроматин гистон

Роль гистонов в свертывании ДНК важна по следующим причинам:

1) Если бы хромосомы состояли только из вытянутой ДНК, трудно вообразить, как они могли бы реплицироваться и разделяться по дочерним клеткам, не запутываясь или не ломаясь при этом. 2) В вытянутом состоянии двойная спираль ДНК каждой человеческой хромосомы пересекла бы клеточное ядро тысячи раз; таким образом, гистоны упорядоченным образом упаковывают очень длинную молекулу ДНК в ядро, имеющее несколько микрометров в диаметре; 3) Не вся ДНК свернута одинаковым образом, и характер упаковки района генома в хроматин, вероятно, влияет на активность генов, содержащихся в данном районе.

В хроматине ДНК простирается как непрерывная двуспиральная нить от одной нуклеосомы к другой. Каждая нуклеосома отделена от следующей участком линкерной ДНК, который варьирует в размерах от 0 до 80 нуклеотидных пар. В среднем повторяющиеся нуклеосомы имеют нуклеотидный интервал, составляющий около 200 нуклеотидных пар. На электронных микрофотографиях такое чередование гистонового октамера с намотанной ДНК и линкерной ДНК придает хроматину вид "бусин на нитке" (после обработок, развертывающих упаковку высшего порядка).

Метилирование как ковалентная модификация гистонов является более сложной, чем любая другая, поскольку оно может происходить как по лизинам, так и по аргининам. Кроме того, в отличие от любой другой модификации в группе 1, последствия метилирования могут быть как позитивными, так и негативными по отношению к транскрипционной экспрессии в зависимости от положения остатка в гистоне (табл. 10.1). Еще один уровень сложности связан с тем фактом, что по каждому остатку могут быть множественные метилированные состояния. Лизины могут быть моно - (me1), ди - (me2) или три - (meЗ) метилированными, тогда как аргинины могут быть моно - (me1) или ди - (me2) метилированными.

Фосфорилирование - лучше всего известная РТМ, поскольку уже давно поняли, что киназы регулируют проведение сигнала с клеточной поверхности через цитоплазму и в ядро, приводя к изменениям в экспрессии генов. Гистоны были одними из первых белков, фосфорилирование которых было обнаружено. К 1991 году открыли, что когда клетки стимулировали к пролиферации, происходила индукция так называемых "немедленных-ранних" ("immediate-early") генов, и они становились транскрипционно активными и функционировали, стимулируя клеточный цикл. Эта повышенная экспрессия генов коррелирует с фосфорилированием гистона НЗ (Mahadevan et al., 1991). Остаток серина 10 гистона НЗ (Н3S10) оказался важным сайтом фосфорилирования для транскрипции от дрожжей до человека и, по-видимому, особенно важен у Drosophila (Nowak and Corces, 2004)

Убиквитинирование Процесс присоединения к белку "цепочки" молекул убиквитина (см. Убиквитин). При У. происходит соединение С-конца убиквитина с боковыми остатками лизина в субстрате. Полиубиквитиновая цепочка навешивается в строго определенный момент и является сигналом, свидетельствующим о том, что данный белок подлежит деградации.

Ацетилирование гистонов играет важную роль в модуляции структуры хроматина при активации транскрипции [Grunstein, ea 1997, Mizzen, ea 1998, Struhl, ea 1998], увеличивая доступность хроматина для транскрипционного аппарата. Полагают, что ацетилированные гистоны менее прочно связаны с ДНК и поэтому транскрипционной машине легче преодолевать сопротивление упаковки хроматина. В частности ацетилирование может облегчать доступ и связывание факторов транскрипции к их элементам узнавания на ДНК. Сейчас идентифицированы ферменты, которые осуществляют процесс ацетилирования и деацетилирования гистонов, и, наверное, скоро мы узнаем больше о том, как это увязывается с активацией транскрипции.

Известно что ацетилированные гистоны признак транскрипционно активного хроматина.

Гистоны - наиболее хорошо биохимически изученные белки.

Организация нуклеосом

Нуклеосома является элементарной единицей упаковки хроматина. Она состоит из двойной спирали ДНК, обмотанной вокруг специфического комплекса из восьми нуклеосомных гистонов (гистонового октамера). Нуклеосома представляет собой дисковидную частицу с диаметром около 11 нм, содержащую по две копии каждого из нуклеосомных гистонов (Н2A, Н2В, НЗ, Н4). Гистоновый октамер образует белковую сердцевину, вокруг которой дважды обмотана двуспиральная ДНК (146 нуклеотидных пар ДНК на гистоновый октамер).

Нуклеосомы, входящие в состав фибрилл, расположены более или менее равномерно вдоль молекулы ДНК на расстоянии 10-20 нм друг от друга.

Данные по структуре нуклеосом получены с использованием рентгеноструктурного анализа низкого и высокого разрешения кристаллов нуклеосом, межмолекулярных сшивок белок-ДНК и расщепления ДНК в составе нуклеосом с помощью нуклеаз или радикалов гидроксила. А. Клугом была построена модель нуклеосомы, в соответствии с которой ДНК (146 п. о.) в B-форме (правозакрученная спираль с шагом 10 п. о.) намотана на гистоновый октамер, в центральной части которого расположены гистоны Н3 и Н4, а на периферии - Н2а и Н2b. Диаметр такого нуклеосомного диска составляет 11 нм, а его толщина - 5,5 нм. Структура, состоящая из гистонового октамера и намотанной на него ДНК, получила название нуклеосомной кoровой частицы. Кoровые частицы отделены друг от друга сегментами линкерной ДНК. Общая длина участка ДНК, включенного в нуклеосому животных, составляет 200 (+/-15) п. о.

Полипептидные цепи гистонов содержат структурные домены нескольких типов. Центральный глобулярный домен и гибкие выступающие N - и С-концевые участки, обогащенные основными аминокислотами, получили название плеч (arm). С-концевые домены полипептидных цепей, участвующие в гистон-гистоновых взаимодействиях внутри кoровой частицы, находятся преимущественно в виде альфа-спирали с протяженным центральным спиральным участком, вдоль которого с двух сторон уложено по одной более короткой спирали. Все известные места обратимых посттрансляционных модификаций гистонов, происходящих на протяжении клеточного цикла или во время дифференцировки клеток, локализованы в гибких основных доменах их полипептидных цепей (табл. I.2). При этом N-концевые плечи гистонов H3 и H4 являются самыми консервативными участками молекул, а гистоны в целом - одними из наиболее эволюционно консервативных белков. С помощью генетических исследований дрожжей S. cerevisiae было установлено, что небольшие делеции и точковые мутации в N-концевых частях генов гистонов сопровождаются глубокими и разнообразными изменениями фенотипа дрожжевых клеток, что указывает на важность целостности молекул гистонов в обеспечении правильного функционирования эукариотических генов. В растворе гистоны Н3 и Н4 могут существовать в виде стабильных тетрамеров (Н3) 2 (Н4) 2, а гистоны Н2А и Н2В - в виде стабильных димеров. Постепенное повышение ионной силы в растворах, содержащих нативный хроматин, приводит к освобождению сначала димеров Н2А/Н2В, а затем тетрамеров Н3/Н4.

Уточнение тонкой структуры нуклеосом в кристаллах было проведено в работе К. Люгера с соавт. (1997 г.) с помощью рентгеноструктурного анализа высокого разрешения. Установлено, что выпуклая поверхность каждого гистонового гетеродимера в составе октамера огибается сегментами ДНК длиной 27-28 п. о., расположенными по отношению друг к другу под углом 140 градусов, которые разделены линкерными участками длиной в 4 п. о.

Уровни компактизации Днк: нуклеосомы, фибриллы, петли, митотическая хромосома

Первый уровень компактизации ДНК - нуклеосомный. Если подвергнуть действию нуклеазы хроматин, то он и ДНК, подвергаются распаду на регулярно повторяющиеся структуры. После нуклеазной обработки из хроматина путем центрифугирования выделяют фракцию частиц со скоростью седиментации 11S. Частицы 11S содержат ДНК около 200 нуклеотидных пар и восемь гистонов. Такая сложная нуклеопротеидная частица получила название Нуклеосомы. В ней гистоны образуют белковую основу-сердцевину, по поверхности которой располагается ДНК. ДНК образуют участок, с белками сердцевины не связанный, - Линкер, Который, соединяя две соседние нуклеосомы, переходит в ДНК следующей нуклеосомы. Они образуют "бусины", глобулярные образования около 10 нм, сидящие друг за другом на вытянутых молекулах ДНК. Второй уровень компактизации-30 нм фибрилла. ПЕрвый, нуклеосомный, уровень компактизации хроматина играет регуляторную и структурную роль, обеспечивая плотность упаковки ДНК в 6-7 раз. В митотических хромосомах и в интерфазных ядрах выявляются фибриллы хроматина с диаметром 25-30 нм. Выделяют соленоидный тип укладки нуклеосом: нить плотно упакованных нуклеосом диаметром 10 нм образует витки с шагом спирали около 10 нм. На один виток такой суперспирали приходится 6-7 нуклеосом. В результате такой упаковки возникает фибрилла спирального типа с центральной полостью. Хроматин в составе ядер имеет 25-нм фибриллы, которая состоит из сближенных глобул того же размера - Нуклеомеров. Эти нуклеомеры называют сверхбусинами ("супербиды"). Основная фибрилла хроматина диаметром 25 нм представляет собой линейное чередование нуклеомеров вдоль компактизованной молекулы ДНК. В составе нуклеомера образуются два витка нуклеосомной фибриллы, по 4 нуклеосомы в каждом. Нуклеомерный уровень укладки хроматина обеспечивает 40-кратное уплотнение ДНК. Нуклесомный и нуклеомерный (супербидный) уровни компактизации ДНК хроматина осуществляются за счет гистоновых белков. Петлевые домены ДНК - третий уровень структурной организации хроматина. В высших уровнях организации хроматина специфические белки связываются с особыми участками ДНК, которая в местах связывания образует большие петли, или домены. В некоторых местах есть сгустки конденсированного хроматина, розетковидные образования, состоящие из многих петель 30 нм-фибрилл, соединяющихся в плотном центре. Средний размер розеток достигает 100-150 нм. Розетки фибрилл хроматина-Хромомеры. Каждый хромомер состоит из нескольких содержащих нуклеосомы петель, которые связаны в одном центре. Хромомеры связаны друг с другом участками нуклеосомного хроматина. Такая петельнодоменная структура хроматина обеспечивает структурную компактизацию хроматина и организует функциональные единицы хромосом - репликоны и транскрибируемые гены.

Используя метод рассеяния нейтронов, удалось установить форму и точные размеры нуклеосом; при грубом приближении - это плоский цилиндр или шайба диаметром 11 нм и высотой 6 нм. Располагаясь на подложке для электронного микроскопирования, они образуют "бусины" - глобулярные образования около 10 нм, гуськом, тандемно сидящие на вытянутых молекулах ДНК. На самом же деле вытянутыми являются только линкерные участки, остальные три четверти длины ДНК спирально уложены по периферии гистонового октамера. Сам гистоновый октамер, как считают, имеет форму, напоминающую мяч для игры в регби, в состав которого входят тетрамер (НЗ-Н4) 2 и два независимых димера Н2А-Н2В. На рис. 60 представлена схема расположения гистонов в сердцевинной части нуклеосомы.

Состав центромер и теломер

Что такое хромосомы, сегодня известно почти каждому. Эти ядерные органеллы, в которых локализуются все гены, и составляют кариотип данного вида. Под микроскопом хромосомы выглядят как однородные, вытянутые темные палочкообразные структуры, и вряд ли увиденная картина покажется интригующим зрелищем. Тем более, что препараты хромосом великого множества живых существ, обитающих на Земле, отличаются разве что числом этих палочек да модификациями их формы. Однако есть два свойства, характерные для хромосом всех видов.

Обычно описывают пять стадий клеточного деления (митоза). Для простоты мы остановимся на трех основных этапах в поведении хромосом делящейся клетки. На первом этапе происходит постепенное линейное сжатие и утолщение хромосом, затем образуется веретено деления клетки, состоящее из микротрубочек. На втором хромосомы постепенно продвигаются к центру ядра и выстраиваются вдоль экватора, вероятно, чтобы облегчить присоединение микротрубочек к центромерам. При этом ядерная оболочка исчезает. На последнем этапе половинки хромосом - хроматиды - расходятся. Создается впечатление, что микротрубочки, прикрепленные к центромерам, как буксир, тянут хроматиды к полюсам клетки. С момента расхождения бывшие сестринские хроматиды называются дочерними хромосомами. Они достигают полюсов веретена и собираются вместе в параллельном порядке. Образуется ядерная оболочка.

Модель, объясняющая эволюцию центромер.

Вверху - центромеры (серые овалы) содержат специализированный набор белков (кинетохор), включающий гистоны CENH3 (H) и CENP-C (C), которые в свою очередь взаимодействуют с микротрубочками веретена деления (красные линии). В различных таксонах один из этих белков эволюционирует адаптивно и согласованно с дивергенцией первичной структуры ДНК центромер.

Внизу - изменения в первичной структуре или организации центромерной ДНК (темно-серый овал) может создавать более сильные центромеры, что выражается в большем количестве присоединяемых микротрубочек.

Теломеры

Термин "теломера" предложил Г. Меллер еще в 1932 г. [5]. В его представлении она означала не только физический конец хромосомы, но и присутствие "терминального гена со специальной функцией запечатывания (пломбирования) хромосомы", которое делало ее недоступной для вредных воздействий (хромосомных перестроек, делеций, действия нуклеаз и т. д.). Наличие терминального гена не подтвердилось в последующих исследованиях, однако функция теломеры была определена точно.

Позднее выявили еще одну функцию. Так как на концах хромосом обычный механизм репликации не работает, в клетке есть другой путь, поддерживающий стабильные размеры хромосом при клеточном делении. Эту роль выполняет специальный фермент, теломераза, которая действует подобно другому ферменту, обратной транскриптазе: использует одноцепочечную РНК-матрицу для синтеза второй цепи и восстановления концов хромосом. Таким образом, теломеры во всех организмах выполняют две важные задачи: защищают концы хромосом и поддерживают их длину и целостность.

Предложена модель белкового комплекса из шести теломер-специфических белков, формирующегося на теломерах хромосом человека [7]. ДНК образует t-петлю, а одноцепочечный выступ внедряется в двухцепочечный участок ДНК, расположенный дистально (рис. 6). Белковый комплекс позволяет клеткам отличать теломеры от мест разрыва хромосом (ДНК). Не все белки теломер входят в состав комплекса, который избыточен на теломерах, но отсутствует в других районах хромосом. Защитные свойства комплекса вытекают из его способности воздействовать на структуру теломерной ДНК по крайней мере тремя способами: определять структуру самого кончика теломеры; участвовать в образовании t-петли; контролировать синтез теломерной ДНК теломеразой. Родственные комплексы найдены и на теломерах некоторых других видов эукариот.

Вверху - теломера в момент репликации хромосомы, когда ее конец доступен для комплекса теломеразы, который осуществляет репликацию (удвоение цепи ДНК на самом кончике хромосомы). После репликации теломерная ДНК (черные линии) вместе с находящимися на ней белками (показаны разноцветными овалами) образует t-петлю (Нижняя часть рисунка).

Время компактизации ДНК в клеточном цикле и основные факторы, стимулирующие процессы

Вспомним строение хромосом (из курса биологии) - их обычно отображают в виде пары букв X, где каждая хромосома является парной, а также каждая имеет две одинаковые части - левую и правую хроматиды. Такой набор хромосом характерен для клетки, уже начавшей свое деление, т. е. клетки, в которой прошел процесс удвоения ДНК. Удвоение количества ДНК называют синтетическим периодом, или S-периодом, клеточного цикла. Говорят, что количество хромосом в клетке остается прежним (2n), а число хроматид в каждой хромосоме - удвоенным (4c - 4 хроматиды на одну пару хромосом) - 2n4c. При делении в дочерние клетки от каждой хромосомы попадет одна хроматида и клетки получат полный диплоидный набор 2n2c.

Состояние клетки (точнее ее ядра) между двумя делениями называют интерфазным. В интерфазе различают три части - пресинтетический, синтетический и постсинтетический периоды.

Таким образом, весь клеточный цикл состоит из 4 отрезков времени: собственно митоза (M), пресинтетического (G1), синтетического (S) и постсинтетического (G2) периодов интерфазы (рис. 19). Буква G - от английского Gap - интервал, промежуток. В G1-периоде, наступающем сразу после деления, клетки имеют диплоидное содержание ДНК на одно ядро (2c). В период G1 начинается рост клеток главным образом за счет накопления клеточных белков, что определяется увеличением количества РНК на клетку. В этот период начинается подготовка клетки к синтезу ДНК (S-периоду).

Обнаружено, что подавление синтеза белка или иРНК в G1-периоде предотвращает наступление S-периода, так как в течение G1-периода происходят синтезы ферментов, необходимых для образования предшественников ДНК (например, нуклеотид-фосфокиназ), ферментов метаболизма РНК и белка. Это совпадает с увеличением синтеза РНК и белка. При этом резко повышается активность ферментов, участвующих в энергетическом обмене.

В следующем, S-периоде происходит удвоение количества ДНК на ядро и соответственно удваивается число хромосом. В разных клетках, находящихся в S-периоде, можно обнаружить разные количества ДНК - от 2c до 4c. Это связано с тем, что исследованию подвергаются клетки на разных этапах синтеза ДНК (только приступившие к синтезу и уже завершившие его). S-период является узловым в клеточном цикле. Без прохождения синтеза ДНК неизвестно ни одного случая вступления клеток в митотическое деление.

Постсинтетическая (G2) фаза еще называется премитотической. Последним термином подчеркивается ее большое значение для прохождения следующей стадии - стадии митотического деления. В данной фазе происходит синтез иРНК, необходимый для прохождения митоза. Несколько ранее этого синтезируется рРНК рибосом, определяющих деление клетки. Среди синтезирующихся в это время белков особое место занимают тубулины - белки микротрубочек митотического веретена.

В конце G2-периода или в митозе по мере конденсации митотических хромосом синтез РНК резко падает и полностью прекращается во время митоза. Синтез белка во время митоза понижается до 25% от исходного уровня и затем в последующих периодах достигает своего максимума в G2-периоде, в общем повторяя характер синтеза РНК.

В растущих тканях растений и животных всегда есть клетки, которые находятся как бы вне цикла. Такие клетки принято называть клетками G0-периода. Именно эти клетки представляют собой так называемые покоящиеся, временно или окончательно переставшие размножаться клетки. В некоторых тканях такие клетки могут находиться длительное время, не изменяя особенно своих морфологических свойств: они сохраняют в принципе способность к делению, превращаясь в камбиальные, стволовые клетки (например, в кроветворной ткани). Чаще потеря (хотя бы и временная) способности делиться сопровождается появлением способности к специализации, к дифференцировке. Такие дифференцирующиеся клетки выходят из цикла, но в особых условиях могут снова входить цикл. Например, большинство клеток печени находится в G0-периоде; они не участвуют в синтезе ДНК и не делятся. Однако при удалении части печени у экспериментальных животных, многие клетки начинают подготовку к митозу (G1-период), переходят к синтезу ДНК и могут делиться митотически. В других случаях, например в эпидермисе кожи, после выхода из цикла размножения и дифференцировки клетки некоторое время функционируют, а затем погибают (ороговевшие клетки покровного эпителия).

Структура и химия хроматина

Похожие статьи