Матеріали та методи дослідження - Будова і властивості ферментів

Завдання на виконання роботи: визначити амілолітичну здатність ферментного препарату за швидкість гідролізу крохмалю до декстринів.

Лабораторний посуд: мірні колби, піпетки, пробірки, скляні палички.

Матеріали і реактиви: 1,0 %-й розчин розчинного картопляного крохмалю (наважку беруть з такого розрахунку, щоб в 100 мл розчину був 1 г сухого крохмалю, кількісно переводять її у велику склянку з киплячою водою, кип'ятять 2 хв й охолоджують, весь час перемішуючи розчин скляною паличкою. Охолоджений крохмаль переносять у мірну колбу того об'єму, із розрахунку на який взята наважка крохмалю, додають буферний розчин у кількості 10 мл на 100 мл розчину і доводять до позначки дистильованою водою. Розчин крохмалю готують у день аналізу); буферний розчин: змішують рівні об'єми нормальних розчинів оцтової кислоти (58 мл льодяної оцтової кислоти в 1 л дистильованої води) та натрій оцтовокислого (82 г CH3COONa або 136,1 г CH3COONa. 3H2O в 1 л води), рН = 4,7; основнй розчин йоду (1,4 г кристалічного йоду і 4,4 г калій йодистого розчиняють у малому об'ємі води і доводять об'єм розчину до 100 мл, зберігають у темному місці); робочий розчин йоду готують в день аналізу (20 мл основного розчину йоду доводять дистильованою водою до 100 мл і на кожні 100 мл робочого розчину додають 4 г йодистого калію); розчин технічного амілосубтиліну (1:1000).

Принцип методу: грунтується на гідролізі 1,0 %-го буферного розчину крохмалю під впливом амілолітичних ферментів. Кінець реакції контролюють візуально за йодною пробою. За часом, протягом якого проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, визначається амілолітична активність препарату.

Хід роботи: У конічну колбу місткістю 50 - 100 мл вносять піпеткою 20 мл 1,0 %-го розчину крохмалю і занурюють у водяну баню з температурою 30 °С (±0,2 °С). Загальний об'єм реакційної суміші завжди має дорівнювати 30 мл, і якщо на аналіз беруть менше 10 мл ферментного розчину, то об'єм, якого не достає, доповнюють дистильованою водою, яку приливають перед додаванням ферментного розчину. Через 10 хв витримування в бані у колбу вносять ферментний розчин при ретельному перемішуванні і точно за секундоміром відмічають час. За початок реакції беруть час, коли з піпетки виллється половина вмісту. Через кожну хвилину (або частіше) після початку реакції скляною паличкою відбирають краплину рідини і на білій порцеляновій пластинці з'єднують її з раніше нанесеною краплиною робочого розчину йоду. Реакція розщеплення крохмалю вважається закінченою, коли йод перестане давати зміну забарвлення при з'єднанні з краплиною дослідної рідини (протягом перших 10 с). Час, за який проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, може становити від 3 до 20 хв, але надійніші результати отримують у межах від 5 до 15 хв. Примітка. Якщо час зникнення забарвлення менше 3 хв, то визначення повторюють з меншою кількістю розчину ферменту, наприклад - 2 мл. У цьому разі в пробірку чи колбу з 20 мл крохмалю вносять 8 мл дистильованої води. Під час аналізу дуже активних препаратів концентрації розчинів роблять меншими (0,1 г в 200 або 500 мл). Якщо час зникнення забарвлення становить більше 20 хв, то готують розчин більшої концентрації, наприклад 1:50 чи 1:100, а рідину можна не 45 розбавляти зовсім. У разі зникнення забарвлення в межах 3 - 5 хв проби відбирають кожні 15 с; 5 - 10 хв - кожні 30 с; а понад 10 хв - кожну хвилину. Скляну паличку після кожної проби промивають дистильованою водою і витирають чистим некрохмаленим рушником. Розрахунок АЗ проводять за формулою:

АЗ = (1.1)

Де 0,2 - кількість крохмалю в реакційній суміші, г; 60 - коефіцієнт перерахунку на 1 год; а - кількість ферментного препарату, введеного в реакційну суміш, грами повітряно-сухої речовини або мл рідинних об'єктів; t - час, за який пройшло розщеплення крохмалю до нездатних забарвлюватися йодом продуктів, хв; 1 - перерахунок на 1 г повітряно-сухого препарату або 1 мл розчину.

Результати

T1=0о С ф=27 хв

T2=20о С ф=8 хв

T3=37о С ф=3 хв

T4=90о С ф=32 хв

АЗ1=

АЗ2=

АЗ3=

АЗ4=

Похожие статьи




Матеріали та методи дослідження - Будова і властивості ферментів

Предыдущая | Следующая