Біохімічні методи визначення життєздатності пилку (методи Шардакова, Діакону) - Визначення життєздатності пилку та зародкового мішка

Життєздатність пилку - це його здатність проростати на приймочці маточки за наявності усіх необхідних сприятливих умов. Зрозуміло, що життєздатний (живий) пилок - дуже активний фізіологічно, а нежиттєздатний - фізіологічно неактивний. Базуючись на цьому, розробили велику кількість методів визначення життєздатності пилку, але жоден з них не є універсальним або таким, що придатен для будь-яких видів рослин.

Метод В. С. Шардакова

Метод базується на тому, що життєздатний пилок містить у великій кількості фермент пероксидазу, а тому легко дає забарвлену сполуку за дії реактивів, які містять бензидин. Нежиттєздатний пилок не містить пероксидази, а тому не забарвлюється.

Для проведення дослідження життєздатності пилку в окремих склянках з темного скла готують чотири розчини.

    1. 0,20 г бензидину основного в 100 мл 50%-го розчину етилового спирту; 2. 0,15 г нафтолу в 100 мл 50%-го розчину етилового спирту; 3. 0,25 г натрію вуглекислого в 100 мл дистильованої води; 4. 0,3% розчин перекису водню.

Безпосередньо перед використанням розчини (1, 2 і 3) змішують у невеликих рівних об'ємах. Цю суміш розчинів і 4-й розчин наливають в окремі крапельниці. Пилок поміщають на предметне скло і піпеткою додають краплю суміші розчинів (1, 2, 3) і через одну хвилину додають краплю розчину 4. Перемішують скляною паличкою і накривають покривним склом.

Спостереження проводять відразу після нанесення краплі розчину 4. Якщо численні бульбашки кисню, що виділяються, будуть заважати вивченню препарату, то їх видаляють підняттям покривного скла. Живий пилок забарвлюється в яскраво-рожевий або темно-червоний колір завдяки наявності пероксидази, а мертвий залишиться безбарвним або жовтуватим. Підрахунки проводять не менше, ніж у 5-х полях зору мікроскопу, заповнюють таблицю.

Таблиця 2

Визначення життєздатності пилку за методом В. С. Шардакова

Вид рослини

***

Стан пилкових

Поле зору

Середній

Зерен

1

2

3

4

5

Відсоток

Забарвлені пилкові

Життєздатного

Зерна

Пилку

Незабарвлені пилкові

Зерна

Життєздатні

У кожному полі зору,

%

Для свіжозібраного пилку цей метод дає задовільні результати, але для пилку, який зберігався, результати виходять дещо завищені.

Метод П. І. Діакону

Життєздатність пилку за методом П. І. Діакону оцінюють за ступенем активності сукциндегідрази. Відомо, що дихання клітин найбільш пов'язане з життєвими процесами і здійснюється за участю ферментів дегідраз. У разі припинення дихання можна говорити про загибель клітин.

Зміну активності сукциндегідрази можна легко визначити за допомогою безбарвного розчину хлориду трифенілтетразола. За наявності активної сукциндегідрази хлорид трифенілтетразола відновлюється до формазану, що має червоний колір. У разі припинення життєвих процесів формазан не утворюється, забарвлення клітин не відбувається.

Для проведення досліджень потрібно виготовити буферний розчин Серенсена з рН 717 за прописом: для 10 мл фосфатного буферного розчину беруть 7 мл 1/15М розчину Na2HРО4-2H2О та додають до нього 3 мл 1/15М розчину КH2РО4.

На предметне скло наносять краплю буферного розчину та додають трохи досліджуваного пилка. Витримують 4-5 хвилин, після цього обережно фільтрувальним папером відсмоктують буферний розчин і додають 1-2 краплі розчину хлориду трифенілтетразолу. Після цього препарат накривають покривним склом і ставлять у термостат на 30 хвилин при температурі 37 єС.

Після завершення експозиції препарат досліджують під мікроскопом, визначаючи забарвлення пилкових зерен не менше, ніж у п'яти полях зору і заповнюють наведену нижче таблицю:

Таблиця 3

Визначення життєздатності пилку за методом П. І. Діакону

Вид рослини

***

Стан пилкових

Поле зору

Середній

Зерен

1

2

3

4

5

Відсоток

Забарвлені пилкові

Життєздатного

Зерна

Пилку

Незабарвлені пилкові

Зерна

Життєздатні

У кожному полі зору,

%

Червоне забарвлення пилкових зерен вказує на їх життєздатність. Мертві пилкові зерна зовсім не забарвлюються та залишаються жовтими.

Похожие статьи




Біохімічні методи визначення життєздатності пилку (методи Шардакова, Діакону) - Визначення життєздатності пилку та зародкового мішка

Предыдущая | Следующая