Методы исследования, Приготовление гистологического препарата - Гистология, цитология и эмбриология
Методы исследования в гистологии включают приготовление гистологических препаратов с последующим их изучением с помощью светового или электронного микроскопа. Гистологические препараты представляют собой мазки, отпечатки органов, тонкие срезы кусочков органов, возможно, окрашенные специальным красителем, помещенные на предметное стекло микроскопа, заключенные в консервирующую среду и покрытые покровным стеклом.
Приготовление гистологического препарата
После забора материала выполняется его подготовка к исследованию, включающая в себя ряд этапов.
- 1. Фиксация (от Лат. Fixatio -- Закрепление) -- фрагмент ткани обрабатывают с помощью жидкости-фиксатора, в роли которого чаще всего выступает Формалин, реже -- спирты, пикриновая кислота и др. Такая обработка предотвращает распад клеток и разрушение структуры ткани под действием собственных ферментов клеток и процессов гниения, таким образом сохраняя прижизненную структуру и делая возможным изучение ткани. Принцип действия фиксирующих жидкостей основан на быстрой гибели клеток и коагуляции белка. Наиболее распространенный тип фиксации -- иммерсионная фиксация (от Лат. Immersio -- Погружение), при которой фрагмент ткани целиком погружается в раствор; в экспериментальных условиях также используют перфузионную фиксацию (от Лат. Perfusio -- Вливание), при которой фиксатор вводят через сосудистую систему.[1]При этом используют как технический формалин (марка ФМ ГОСТ 1625-89), так и подготовленный ("забуференный" формалин), который отличается большей стабильностью -- не образуется белый осадок, свойственный техническому формалину при температуре ниже 40 °С. 2. Проводка -- процесс дегидратации (обезвоживания) фрагмента ткани и пропитки его Парафином. Этот этап обеспечивает уплотнение ткани, которое, в свою очередь, необходимо для получения срезов (если ткань будет излишне мягкой, то при Микротомировании она будет "сминаться", образуя складки, разрывы и другие артефакты, делающие ее непригодной к изучению). Традиционно проводку осуществляли путем последовательного погружения ткани в растворы Ксилола и Этилового спирта, однако такой метод имеет ряд существенных недостатков, как-то: трудоемкость, длительность (до четырех суток), испарение реагентов в воздух лаборатории (что небезопасно для сотрудников лаборатории, так как ксилолы образуют взрывоопасные паровоздушные смеси, вызывают острые и хронические поражения кроветворных органов, при контакте с кожей -- дерматиты), а также нестабильное качество получаемой ткани, зависящее от Человеческого фактора, а именно действий лаборанта. Для решения проблем такого рода лаборатории используют альтернативные реагенты, такие как Изопропанол, являющийся нетоксичным, а также аппараты -- Гистопроцессоры, имеющие закрытый контур и таким образом не допускающие испарений в воздух лаборатории. Путем использования гистопроцессоров также можно значительно уменьшить время проводки по сравнению с ручным методом (до одного часа при использовании гистопроцессора Xpress 120) за счет применения вакуум-инфильтрационной и микроволновой методик. 3. Заливка -- процесс создания блока, достаточно твердого, чтобы быть пригодным для резки (Микротомирования). Выполняется путем заливания фрагмента ткани жидкимПарафином, Целлоидином, пластмассой или специальными средами для заливки. Затем залитую ткань остужают до затвердевания блока. Целлоидин в настоящее время практически не используется; чистый парафин также обладает рядом недостатков, делающих его непригодным для исследования -- при его затвердевании образуются кристаллы, уменьшающие его объем на 5-10 %, что, в свою очередь, ведет к деформации ткани, а также из-за кристаллической структуры он легко крошится при резке. Поэтому чаще всего для изготовления блоков пользуются специальными заливочными средами, представляющими собой смесь парафинов с присадками в виде рисового, пчелиного Воска или Полимеров. Эти присадки придают парафину эластичность, что не дает ему крошиться при резке. Чтобы создать гомогенную среду для заливки, воск и парафин расплавляют, охлаждают и тщательно перемешивают, повторяя всю процедуру 5-10 раз. Это достаточно трудоемкий процесс, качество получаемой среды нестабильно, поэтому некоторые лаборатории пользуются готовыми средами для заливки, изготовленными в заводских условиях и не требующих дополнительной гомогенизации. 4. Резка, или микротомирование, представляет собой изготовление тонких срезов на специальном приборе -- Микротоме. Толщина срезов, предназначенных для световой микроскопии, не должна превышать 4 -- 5 мкм, для электронной -- 50 -- 60 нм. 5. Окрашивание срезов позволяет выявить структуру ткани за счет неодинакового химического сродства различных элементов ткани к гистологическим красителям. Например,Окраска гематоксилином и эозином позволяет выявить кислые структуры ткани, такие как ДНК и РНК, за счет их связывания с гематоксилином, имеющим щелочную реакцию, и цитоплазму клеток, которая связывается с эозином (Основная статья -- Окраска гематоксилином и эозином). Перед окрашиванием выполняется монтирование среза на предметное стекло. Для избежания формирования складок срез после микротомирования помещают на поверхность подогретой воды, где он расправляется, а потом уже на стекло. Окрашивание, как и все остальные стадии процесса изготовления гистологического препарата, может выполняться вручную и автоматически. Различают традиционное окрашивание и Иммуногистохимическое. 6. Заключение срезов представляет собой помещение окрашенного среза, монтированного на предметном стекле, под покровное стекло с использованием среды для заключения, имеющий коэффициент преломления, близкий к таковому у стекла -- канадский бальзам, полистирол, специальные среды для заключения. Заключенный препарат можно хранить достаточно длительное количество времени (исключение -- при использовании полистирола препарат постепенно теряет прозрачность, а сам полистирол трескается. Данные изменения при заключении полистеролом значительно уменьшаются если в полистерол добавить пластификатор например Дибутилфталат, при таком условии срок годности гистопрепарата увеличивается до 10 лет даже без покровного стекла, в течение 3 лет изменений практически не происходит).
Похожие статьи
-
Методы исследования - Гистология, цитология и эмбриология
В современной гистологии, цитологии и эмбриологии применяются разнообразные методы исследования, позволяющие всесторонне изучать процессы развития,...
-
Методы микроскопирования гистологических препаратов - Гистология, цитология и эмбриология
Микроскопия может быть Световая (с использованием светового микроскопа) и Электронная (с использованием электронного микроскопа). Световая микроскопия...
-
Содержание дисциплины, история развития, методы исследования - Гистология, цитология и эмбриология
Организм человека и животных представляет собой целостную систему, в которой можно выделить ряд иерархических уровней организации живой материй: клетки...
-
Микроскопический метод исследования предусматривает наблюдение за живыми и убитыми микробами в окрашенном и неокрашенном состоянии. Различают простые и...
-
6.1 манифестная форма (на ЭКГ признаки предвозбуждения желудочков в виде дельта-волны) 6.2 преходящая форма (эпизоды ЭКГ, на которых регистрируются...
-
Материал исследования Исследования проводили в период вегетативного сезона 2011-2015 гг. Сбор осуществляли преимущественно маршрутным методом. В ходе...
-
История открытия и методы исследования вирусов - Вирусы и их особенности
В 1852 г. русский ботаник Д. И. Ивановский впервые получил инфекционный экстракт из растений табака, пораженных мозаичной болезнью. Когда такой экстракт...
-
Характеристика пациентов, включенных в исследование, понятие показателя "плотности доз". Всего обследовано 566 больных, находившихся с различными формами...
-
Материал для исследования следует брать по возможности до начала химиотерапии и лучше во время вскрытия или дренирования гнойного очага. Особенно...
-
Биологическими маркерами принято считать устойчивые биохимические, физиологические, анатомические и иные признаки организмов, варьирующие в норме в...
-
В целях повышения эффективности стоматологического ортопедического лечения челюстно-лицевых больных стоит острая необходимость исследования микрофлоры...
-
Законы наследственности, Достижения современной цитологии - Цитологические исследования
Второй этап в развитии цитологии как науки охватывает 1900-1935. Он наступил после того, как в 1900 были вторично открыты основные законы...
-
Ионизационное излучение не воспринимается органами чувств, следовательно, для их обнаружения используют те эффекты, которые визируют излучение на...
-
В каждом организме (животном, растительном или микробной клетке) все время происходят сложные процессы превращения веществ. Велика роль в этих процессах...
-
1)Мацерация Препараты костей готовятся методом мацерации (отгнивание, разрыхление, размачивание). Очищенные от мягких тканей кости (скоблить их ножом...
-
Понятие "стресс-теста" в кардиологии включает в себя оценку функционального резерва и состояния сердечно-сосудистой системы при выполнении различных...
-
Методы, используемые в исследовании: Анкетирование - метод получения психологической информации, а также социологических и демографических данных -...
-
ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД - Методы исследования вирусов
Иммунофлюоресцентный метод, или реакция иммунофлюоресценции (РИФ), используется в микробиологических лабораториях, оборудованных люминесцентным...
-
Исследования полостных или трубчатых органов, заключающиеся в непосредственном осмотре их внутренней поверхности с помощью особых приборов - Эндоскопов...
-
Основаны на регистрации электропотенциалов или звуковых явлений, возникающих в работающем органе. Электрокардиография (ЭКГ) - Метод, основанный на...
-
Перспективность использования растительных препаратов в медицине обусловлена также возможной минимизацией их токсических эффектов в млекопитающих, что...
-
Б. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТКИ - Основные положения учения о клетке
1) Методы исследования структурной организации клетки. Световая микроскопия. * Получение четких изображений мелких (недоступных человеческому глазу)...
-
В настоящее время оценка генетической структуры различных популяций осуществляется с использование биологических и небиологических источников информации,...
-
Методы исследования Испытуемым на первом этапе было предложено ответить на вопросы о заинтересованности в психотерапии: - Хотите ли Вы обратиться к...
-
Основные методы, которые были использованы при исследовании видов рода Amanita Fr. - это среднемасштабный маршрутный метод исследования микобиоты и...
-
Методы исследования вирусов - Вирусы и их особенности
Исторически вирусология отпочковалась от микробиологии, и хотя микробиологическая техника не могла быть использована при работе с вирусами, такие общие...
-
Не существует таких явлений природы, технических или социальных процессов, которые были бы предметом изучения математики, но при этом не относились бы к...
-
Общенаучные методы исследования - Методология научного исследования в естествознании
Процесс познания как основа любого научного исследования представляет собой сложный диалектический процесс постепенного воспроизведения в сознании...
-
Метод исследования в свете люминесценции - Методы изучения клетки
Метод Исследования в свете люминесценции состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их...
-
Полиморфные белки - Методы исследования популяции человека
Изучая генетическую структуру населения определенного региона проводятся исследования генетико-биохимического полиморфизма систем транспортных белков...
-
Физика как наука, цели, задачи и методы исследования - Физическая картина мира
Физика - наука, изучающая простейшие и вместе с тем наиболее общие закономерности явлений природы, свойства и строение материи, а также законы ее...
-
Методы биологических исследований - Аналогия и моделирование в биологических исследованиях
Когда мы говорим о биологии, мы говорим о науке, которая занимается исследованием всего живого. Все живые существа, включая ареал их обитания, изучаются....
-
Организм животного имеет сложное строение и состоит из клеток, тканей и органов. Все эти структуры взаимосвязаны между собой, при этом клетки (наименьшие...
-
Биотехнологическая стадия - Производство биоферментных препаратов
Основной стадией является собственно биотехнологическая стадия, на которой с использованием того или иного биологического агента (микроорганизмов,...
-
Ветспециалистам, осуществляющим отбор проб для исследования в ветлабораторию, необходимо знать, что патологический материал от павшего и вынужденно...
-
Эксперименты выполнены на 350 белых беспородных крысах и крови 100 здоровых людей - доноров областной станции переливания крови. Все исследования на...
-
ДНК-маркеры - Методы исследования популяции человека
Для изучения структуры генофонда и этногенеза современных популяций человека в качестве первых молекулярно-генетических маркеров стали использовать...
-
Кора больших полушарий. Современные методы исследования функций мозга - Предмет и задачи физиологии
"Мозг - это последняя из тайн природы, Которая когда-либо откроется человеку." Англ. физиолог Чарлз Скотт Шеррингтон. "Асимметрия является основным...
-
Современные стандартизованные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам подразделяют на две группы: 1. Диффузные...
-
Математика представляет собой науку, расположенную как бы на границах естествознания. Вследствие этого ее иногда рассматривают в рамках концепций...
Методы исследования, Приготовление гистологического препарата - Гистология, цитология и эмбриология