Изучение реакции растений семейства бобовые на действие ионного стресса (Н+ И AL3+) в культуре in vitro

Введение

Отрицательное действие высокой кислотности в значительной степени связано с увеличением растворимости соединений алюминия и марганца в почве. Повышенное содержание их в растворе ухудшает развитие растений даже сильнее, чем избыток ионов водорода [1, 2]. При этом резко снижается зимостойкость озимых культур, клевера, люцерны, большинство растений выпадает. Токсическое действие ионов AL3+ и Н+ проявляется в процессе всего онтогенеза и приводит к уменьшению как количества листьев, так и площади одного листа, отмечаются негативные изменения в генеративной сфере растений, снижается их зимостойкость и возрастает степень поражения болезнями. Наиболее чувствительны к алюминию свекла столовая и сахарная, клевер, люцерна и др. Одним из направлений интенсификации селекции бобовых на устойчивость к ионному стрессу, наряду с традиционными методами, все большее применение находит селективный отбор в услових in vitro устойчивых генотипов с их последующим микроклональным размножением на основе методов биотехнологии. Это особенно важно, когда при ограниченном количестве ценных генотипов требуется получить большое количество регенерантов, которые могли бы быть использованы для практической селекции.

Анализ источников

Установлено, что ионы алюминия могут проникать сквозь плазматическую мембрану и до 99 % общего клеточного алюминия может аккумулироваться на клеточной стенке [7, 8, 11]. Широко известно действие алюминия на растяжение и деление клеток: ионы алюминия снижают не только степень растяжения, но и увеличивают частоту появления аберрантных клеток, причем большинство аберраций в тканях корня геномные и хроматидные, на долю хромосомных аберраций приходится не более 7 % [3, 5]. Алюминий может значительно уменьшать концентрацию кальция и магния в тканях. Визуально эффект алюминиевой токсичности наблюдается как ослизнение корней, отсутствие роста корневых волосков, резкое снижение поглощения ионов, снижение активности симбионтов на корнях и, как следствие, ухудшение величины и качества урожая [5, 8]. Растения особенно чувствительны к подвижным формам алюминия и марганца в первый период роста и во время перезимовки.

Разная чувствительность растений к подвижным формам алюминия связана с неодинаковой способностью их связывать этот элемент в корнях. Более устойчивы к алюминию растения, способные фиксировать его в корневой системе, в результате чего он не поступает в точки роста и генеративные органы [10, 11]. В почвенных условиях часто невозможно разграничить отрицательное действие на растения подвижных форм алюминия и марганца и отрицательное действие повышенной концентрации ионов водорода в растворе. Особенно негативный эффект проявляется на ранних стадиях развития растений, т. к. на этом этапе механизм устойчивости недостаточно сформирован.

При высоком содержании подвижных соединений алюминия и марганца в почве отрицательное действие кислотности на растения проявляется значительно сильнее. При этом уменьшается скорость роста корня и клетки не способны удлиняться в среде с ионами алюминия. Вероятно, ионы алюминия взаимодействуют с белками и пектиновыми веществами растягивающихся клеточных стенок. Такие нарушения являются необратимыми. Устойчивость к токсичному действию Al широко варьирует в зависимости от вида культуры, ее сорта и происхождения семенного материала. Устойчивость к алюминиевой токсичности - это мультигенная и комплексная характеристика генома, она является частью общей устойчивости организма. Данный факт позволил нам провести браковку неустойчивых генотипов уже на первых этапах исследования.

Методы исследований

Исследования проводились в 2005-2011 гг. в отделе селекции многолетних бобовых трав и лаборатории генетики и биотехнологии РУП "НПЦ НАН Беларуси по земледелию". Для получения устойчивых генотипов использовали проростки материнских растений клевера лугового (Працаўнiк, М4 24 Ф, АМ, АМП, Самосовместимый), эспарцета (№ 1, 6, 121, 238, 23С-80, Каупацкий) и донника белого (ППР № 1, ППР № 3, 10 ДВ, ДБ 1М, ДБ 3М, ДБ 5М). С целью обеззараживания семена клевера и донника стерилизовали концентрированной серной кислотой в течение 30-40 минут, а эспарцета - 20 минут с последующей пятикратной промывкой дистиллированной водой. Затем высевали стерильные семена клевера и донника на питательную среду Ѕ В5, а эспарцета на среду МС с низкой рН (4,2) и с добавлением ионов алюминия (алюмокалиевые квасцы KAl(SO4)2Х12H2O). Эмпирический расчет содержания ионов алюминия в питательной среде проводили в соответствии с методикой для лабораторных работ [4]. В наших предыдущих экспериментах в 2005-2006 гг. на примере клевера лугового было установлено, что ионы Н+ оказывали значительно меньшее отрицательное действие на проростки, чем ионы алюминия. Поскольку целью проводимых исследований был отбор устойчивых к действию ионов алюминия генотипов, то с целью упрощения схемы исследования и ускорения процесса отбора мы пренебрегли влиянием ионов Н+ и учитывали в дальнейших исследованиях только влияние ионов алюминия.

Исследования закладывались по следующей схеме:

1. Контроль (рН 5,8); 2. рН 4,2 и Al3+ 0,5 мг/л; 3. рН 4,2 и Al3+ 1,0 мг/л; 4. рН 4,2 и Al3+ 2 мг/л.

В качестве контроля были заложены варианты с оптимальным для бобовых уровнем рН - 5,8. При концентрации ионов алюминия 2 мг/л нивелировалась разница по устойчивости проростков между образцами донника. У всех образцов наблюдалась высокая гибель проростков и уродливость выживших растений, поэтому в дальнейших экспериментах данная концентрация была исключена.

Семена проращивали при температуре 20-23єС в течение 3-4 суток от начала наклевывания до появления гипокотиля с семядольными листьями. После 5-ти суток выращивания на селективных средах проводили первый отбор проростков. Для дальнейшего изучения отбирались проростки с хорошо развитым главным корнем и семядолями, из которых выделялись сложнокомплексные экспланты, способные к интенсивной прямой регенерации в условиях in vitro [5]. Отобранные генотипы высаживали в пробирки со средой аналогичного состава.

Основная часть

Ион бобовые алюминий стресс

Влияние ионов алюминия на растения из рода донник изучалось на примере 6 образцов донника белого. В качестве контроля был взят образец 10ДБ, который обладал высокими всхожестью и количеством нормально развитых растений.

У образцов донника белого всхожесть семян изменялась в интервале 68,6-97,1 %, а доля нормально развитых растений варьировала в интервале 1,8-89,7 %. (табл. 1). При этом следует отметить, что с увеличением концентрации ионов алюминия в питательной среде снижалась как всхожесть, так и количество нормально развитых растений. Так, например, у образца донника белого 10ДБ было минимальное снижение всхожести (на 0,9 %) и составило 93,3 %, в то время как у образца донника белого ДБ 3М - максимальное с 24,9 до 1,8 % (на 23,9 %).

Таблица 1

Всхожесть семян и развитие проростков донника белого в зависимости от сорта и концентрации ионов алюминия

Вариант опыта	Всхожесть, %	Нормально развитых, %
10ДБ
РН 5,8 контроль	91,0	100,0
РН 4,2, алюминий 0,5 мг/л	94,2	86,2
РН 4,2, алюминий 1 мг/л	93,3	89,7
Коптевский ППР № 1
РН 4,2, алюминий 0,5 мг/л	93,8	51,0
РН 4,2, алюминий 1 мг/л	72,5	15,2
Коптевский ППР № 3
РН 4,2, алюминий 0,5 мг/л	68,6	24,9
РН 4,2, алюминий 1 мг/л	79,3	1,8
ДБ 1 М
РН 4,2, алюминий 0,5 мг/л	97,1	47,1
РН 4,2, алюминий 1 мг/л	91,8	12,8
ДБ 3 М
РН 4,2, алюминий 0,5 мг/л	93,3	46,7
РН 4,2, алюминий 1 мг/л	69,4	23,1
ДБ 5 М
РН 4,2, алюминий 0,5 мг/л	91,7	19,6
РН 4,2, алюминий 1 мг/л	91,8	7,5

Однако следует отметить, что у двух образцов донника белого с повышением концентрации ионов алюминия не произошло снижения всхожести. Так, у образца Коптевский ППР № 3 всхожесть увеличилась на 10,7 %, а у образца ДМ 5М - на 0,1 %. Однако увеличение концентрации ионов алюминия с 0,5 мг до 1,0 мг привело к существенному снижению нормально развитых растений у данных образцов до 1,8 % и 7,5 % соответственно, как впрочем и у остальных образцов, за исключением сортообразца 10ДБ, у которого с увеличением концентрации ионов алюминия произошло незначительное увеличение нормально развитых растений (на 3,5 %). В результате изучения образцов донника белого установлено, что с увеличением концентрации ионов алюминия происходит снижение всхожести и нормально развитых растений, за исключением образца донника белого 10ДБ, у которого при увеличении концентрации ионов алюминия было минимальное снижение всхожести (на 0,96 %) и отмечен рост нормально развитых растений при высоких абсолютных значениях признаков, в сравнении с прочими образцами донника белого. Наименее устойчивым к действию ионного стресса оказался образец донника белого Коптевский ППР № 3, у которого отмечены самые низкие показатели как по всхожести (68,6-72,5 %), так и по числу нормально развитых проростков (24,9-1,8 %).

Изучение реакции сортов клевера на ионы алюминия проводилось на диплоидных и тетраплоидных образцах. Установлено, что практически у всех образцов незначительно снизились изучаемые показатели при увеличении концентрации ионов алюминия с 0,5 мг/л до 1,0 мг/л, за исключением диплоидного образца М4 23Ф. У данного образца в варианте без ионов алюминия были наиболее высокие как всхожесть, так и процент нормально развитых растений по сравнению с прочими изучаемыми образцами. Однако при концентрации ионов алюминия 0,5 мг/л всхожесть снизилась до 39,1 %, а при 1,0 мг/л - до 5,6 %, а процент нормально развитых растений снизился с 80,8 % до 16,0 % и 4,0 % соответственно. Поэтому было принято решение изучить реакцию всех образцов (за исключением М4 23Ф) при более высокой концентрации ионов алюминия - 2,0 мг/л.

Установлено, что у диплоидного образца АМ с увеличением концентрации ионов алюминия с 1 мг/л до 2,0 мг/л произошло существенное снижение всхожести с 70,3 % до 47,4 %, в то время как гибрид АМП в значительно меньшей степени реагировал на повышение концентрации ионов алюминия. Поскольку при концентрации ионов алюминия 1,0 мг/л всхожесть семян у данного образца была выше на 9,6 %, чем у гибрида АМ, а при концентрации 2,0 мг/л - на 31,3 %. Как следствие, всхожесть в гибридной комбинации АМП составила 78,7 %, что оказалось даже выше, чем в контрольном варианте (рис. 1). При этом следует отметить, что в данном образце отмечено также значительно меньшее снижение процента нормально развитых растений при увеличении концентрации ионов алюминия до 2,0 мг/л. Оно снизилось на 31,2 %, в то время как у образца АМ - на 76,9 %. Вероятнее всего более высокие значения признаков в гибридной комбинации АМП обусловлены влиянием генотипа сорта Працаyнiк, поскольку при концентрации ионов алюминия 1,0 мг/л всхожесть в данном сорте составила 75,3 %.

Рис. 1 Всхожесть образцов диплоидного клевера в зависимости от концентрации ионов алюминия, %

При анализе тетраплоидного образца Самосовместимый установлена интересная закономерность. При увеличении концентрации ионов алюминия до 1,0 мг/л происходит снижение как всхожести, так и нормально развитых растений, в то время как при повышении концентрации до 2,0 мг/л повышается как всхожесть, так и процент нормально развитых растений, при этом значения признаков даже выше, чем в контрольном варианте (рис. 2). Вероятнее всего, это объясняется влиянием более высокой плоидности данного образца.

Рис. 2 Всхожесть семян и развитие проростков образца тетраплоидного клевера Самосовместимый в зависимости от концентрации ионов алюминия, %

В результате изучения образцов клевера установлено, что путем целенаправленной селекционной работы можно создать образцы диплоидного клевера, которые будут более устойчивы к повышенным концентрациям ионов алюминия и обладать при этом высокой всхожестью (свыше 70 %) и количеством нормально развитых растений (60 % и выше).

При изучении влияния концентрации ионов алюминия на всхожесть семян и развитие проростков эспарцета установлено, что при концентрации ионов алюминия 0,5 мг/л только у образца № 23С-80 (отбор из эспарцета виколистного дикорастущего) не произошло снижения всхожести, которая, как и в контрольном варианте, составила 100 % (табл. 2). В прочих вариантах произошло снижение всхожести на 2,8-9,0 %. При увеличении концентрации ионов алюминия до 1,0 мг/л практически во всех вариантах произошло снижение всхожести до 81,3-91,5 %. И лишь в варианте "отбор из эспарцета Закавказского (СР)" при увеличении концентрации ионов алюминия произошло не снижение, а незначительное увеличение всхожести с 91,7 % до 95,6 %. Что касается показателя "процент нормально развитых растений", то во всех вариантах с увеличением концентрации ионов алюминия снижается процент нормально развитых растений. Минимальное снижение процента нормально развитых растений (4,9 %) было в варианте "отбор из эспарцета песчаного дикорастущего" при невысоком проценте нормально развитых растений (25,5 %), в то время как в контрольном варианте данный показатель составил 85,0 %. В меньшей степени, по сравнению с прочими вариантами, на повышение концентрации ионов алюминия среагировал вариант № 238 (отбор из сорта эспарцета Закавказского АЗН НИСХИ-78). В данном варианте с повышением концентрации ионов алюминия до 1,0 мг/л процент нормально развитых растений составил 58,6 %, в то время как в прочих вариантах - 13,9-27,5 %. Поэтому с целью создания нового исходного материала, устойчивого к повышенным концентрациям ионов алюминия, была проведена гибридизация. В качестве родительских форм были использованы образцы эспарцетов песчаного и Закавказского.

Таблица 2

Всхожесть семян и развитие проростков эспарцета в зависимости от концентрации ионов алюминия

Вариант опыта	Всхожесть, %	Нормально развитых, %
Отбор из сорта эспарцета Закавказского АЗН НИСХИ-78 (№ 238)
Контроль, рН 5,8	100,0	85,0
РН 4,2,алюминий 0,5 мг/л	97,2	63,8
РН 4,2,алюминий 1 мг/л	81,3	58,6
Отбор из эспарцета виколистного дикорастущего (№ 23С-80)
РН 4,2,алюминий 0,5 мг/л	100,0	40,0
РН 4,2,алюминий 1 мг/л	91,5	27,5
Отбор из эспарцета песчаного дикорастущего (СМ)
РН 4,2,алюминий 0,5 мг/л	91,0	30,4
РН 4,2,алюминий 1 мг/л	90,0	25,5
Отбор из эспарцета Закавказского (СР)
РН 4,2,алюминий 0,5 мг/л	91,7	20,5
РН 4,2,алюминий 1 мг/л	95,6	13,9
НСР, 05	6,83	11,49

Установлено, что при концентрации ионов алюминия 0,5 мг/л и 1,0 мг/л у отдельных сортообразцов значения изучаемых признаков были на уровне контрольного варианта или выше, поэтому с целью выявления образцов эспарцета, в меньшей степени реагирующих на повышенные концентрации ионов алюминия, данные сортообразцы были изучены при концентрации ионов алюминия 2,0 мг/л. Установлено, что при подобной концентрации у двух сортообразцов значения изучаемых признаков оказались выше, чем в контрольном варианте (№ 103 и № 121). У данных образцов всхожесть составила 91,1 % и 95,1 % соответственно, в то время как в контрольном варианте - 81,3 % (рис. 3). Что касается показателя процент нормально развитых растений, то если в контрольном варианте этот показатель составил 42,6 %, то в данных вариантах - 53,4 % (№ 103) и 43,4 % (№ 121).

Рис. 3 Всхожесть семян и развитие проростков гибридных образцов эспарцета при концентрации ионов алюминия 2,0 мг/л, %

Таким образом, сравнительное изучение разных бобовых культур показало, что, несмотря на то что бобовые культуры в сильной степени снижают всхожесть и процент нормально развитых растений на среде, содержащей ионы алюминия, при целенаправленной селекционной работе по данному признаку можно выявить или создать новый исходный материал, обладающий повышенной устойчивостью к действию ионов алюминия. В качестве источников можно использовать образцы 10ДБ (донник белый), сорт клевера Працаyнiк и образцы эспарцета № 103 и № 121.

Литература

1. Авдонин, Н. С. Повышение плодородия почв Нечерноземной полосы / Н. С. Авдонин. М.: МГУ, 1966. 80 с. 2. Авдонин, Н. С. Повышение плодородия кислых почв / Н. С. Авдонин. М.: Колос, 1969. 304 с. 3. Климашевский, Е. А. О локализации механизма, ингибирующего рост действия Al3+ в растягивающихся клеточных стенках / Е. А. Климашевский, В. М. Дедов // Физиология растений. 1975. Т. 22. № 6. С. 1183-1190. 4. Лабораторные работы по физиологии растений с основами биохимии. Горки, 1980. С. 73-75. 5. О действии алюминия на проростки пшеницы при разных значениях рН среды культивирования / Б. И. Сынзыныс [и др.] // Сельскохозяйственная биология - 2004. № 3. С. 80-84. 6. Cumming, J. R. Arbuscular mycorrhizal fungi enhance aluminium resistance of broomsedge (Andropogon virginicus L.) / J. R. Cumming, J. Ning // Journal of Experimental Botany Advance Access, 2003. V 54. №. 386. Р. 1447-1459. 7. Delhaize, E. Al-tollerance in wheat. Aluiminium Stimulated Excretion / E. Delhaize, P. Ryan, P. Rendall // Plant Physiology, 1993. V. 103. P. 695-702. 8. Lazof, D. B. The in situ analysis of intracellular aluminum in plants - Режим доступа: http: // www. jstor. org/discover/ 10.2307/4277441? uid=3737704&;uid=2129&;uid=2&;uid=70&;uid=4&;sid=47698857227917. Дата доступа: 5 марта 2012 г. 9. Ma, I. F. Specific secretion of citric acid induced by Al-stress in Crassia tora L. / I. F. Ma, S. Y. Zheng, H. Matsumoto // Plant and Cell Physiology, 1997. V 38. № 9. P. 1019-1025. 10. Osawa, H. Possible involvement of protein phosphorylation in aluminum-responsive malate efflux from wheat root apex / H. Osawa, H. Matsumoto // Plant Physiologу, 2001. № 126. P. 411-420. 11. Rengel, Z. Uptake of Al across the plasma membrane of plant cells / Z. Rengel, R. Reid // Plant and Soil, 1997. V. 192. Р. 31-35.

Изучение реакции растений семейства бобовые на действие ионного стресса (Н+ И AL3+) в культуре in vitro

Похожие статьи