Подготовка растительного материала, стерилизация эксплантов, термотерапия и химиотерапия, Условия культивирования регенерантов - Оздоровление и микроклональное размножение роз
С целью получения эксплантов для каллусной и опухолевой культур, микроклонального размножения, изучения гормональной регуляции используют стерильные проростки. Семена для проращивания высевают либо на воду, либо на питательную среду.
Растительные объекты перед стерилизацией тщательно отмывают проточной водой, иногда с моющими средствами, очищают от излишних тканей. С корнеплодов и корней снимают кожуру, с побегов - кору, с почек - кроющие чешуи.
Растительные экспланты стерилизуют растворами веществ, содержащими активный хлор (хлорамином, гипохлоритом Nа), бром (бромной водой), tween-20, перекисью водорода, спиртом, нитратом серебра, диацидом, антибиотиками. Следует подбирать такие концентрации стерилизующих агентов, которые не повреждали бы сами семена, не угнетали их всхожесть и обеспечивали максимальную стерильность.
Этиловый спирт часто применяют для предварительной стерилизации, протирая им поверхность материала или погружая материал на несколько секунд в абсолютный спирт. Иногда такой стерилизации достаточно, ее используют при работе с плодами, семенами, побегами, завязями.
Гипохлорит кальция (хлорная известь) используется в виде 5-7% раствора для обработки почек, завязей, цветков, семян, побегов в течение 5-8 минут.
Гипохлорит натрия используется в виде 0,5-5% раствора для обработки любых эксплантов в течение 1-20 минут. Это вещество является клеточным ядом, поэтому время стерилизации и концентрацию подбирают экспериментально. Например: для изолированных зародышей используют 2-3% раствор в течение 10-15 минут, а для сухих семян 3-5% раствор в течение 1 часа. Остатки гипохлорита натрия сначала удаляют 0,01 н HCl, а затем 8 раз промывают автоклавированной дистиллированной водой.
Хлорамин применяют в концентрации 1-6%. Пыльники и молодые зародыши обрабатывают в течение 1-3 минут, сухие семена - 30-60 минут, затем промывают стерильной дистиллированной водой 2-3 раза.
Сулема - токсичное вещество и требует особой тщательности, как при хранении, так и при подборе концентрации для отдельных объектов. Для стерилизации зародышей используют 0,1% раствор в течение 1-3 минут, для корней и клубнеплодов - до 10-20 минут.
Растворы, содержащие активный хлор используются 1 раз и готовят их непосредственно перед работой.
Диацид используется в 0,2% растворе для стерилизации корнеплодов, семян, кусочков, тканей, верхушечных меристем, изолированных зародышей, пыльников. Диацид готовят, растворяя отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридиния хлорида в горячей воде (330 мл), затем их смешивают и доводят объем жидкости до 1 л, добавляют несколько капель детергента твин-80; хранят в плотно закрытой колбе в темноте.
Антибиотики применяют для стерилизации растительного материала, инфицированного бактериями (ткани корончатогалловых опухолей). Наиболее часто применяют стрептомицин и тетрамицин 10-80 мг/л, ампициллин 200-400 мг/л, левомицитин, канамицин и другие.
В качестве стерилизующего агента применяют также перекись водорода, которая менее всего повреждает экспланты и после которой не требуется отмывка в стерильной воде, так как она быстро разлагается.
Стерилизацию эксплантов необходимо проводить в стерильных (асептических) условиях: в ламинарном боксе.
Колбы с эксплантами после помещаются в абсолютную темноту при комнатной температуре на неделю для выявления степени стерильности. Те колбы, в которых началось заражение, следует сразу удалять (Шевелуха В. С., 1998).
Снизить риск попадания вирусов в здоровые ткани можно путем применения предварительной термотерапии или химиотерапии исходных растений. Метод термотерапии применяется как в условиях in vivo, так и in vitro и предусматривает использование горячего сухого воздуха. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной из них при высоких температурах разрушаются белковая оболочка и нуклеиновая кислота вируса. Вторая гипотеза предполагает действие высоких температур на вирусы через метаболизм растений. При такой температуре начинает преобладать деградация вирусных частиц, а синтез их, наоборот, уменьшается. Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в термокамеры, где температура в течение первой недели повышается с 25 до 37 ОС путем ежедневного увеличения температуры на 2 градуса. Все остальные режимы обязательно поддерживаются в оптимальном состоянии: освещенность, высокая относительная влажность воздуха, определенный фотопериод. Продолжительность термостатирования зависит от состава вирусов и их термостойкости. Если для гвоздики достаточно 10 - 12 недельного воздействия теплом, то для хризантемы этот период превышает 12 недель.
Помимо положительного действия высоких температур на освобождение от вирусов, выявлено аналогичное влияние их на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздики, фрезии) в условиях in vitro. Высокие температуры увеличивают коэффициент размножения на 50 - 60%, повышают адаптацию пробирочных растений к почвенным условиям и позволяют получить больше безвирусных маточных растений.
Другой способ оздоровления - химиотерапия. В питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, добавляют препарат вирозола в концентрации 20 - 50 мг/л, не больше. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. Применение его позволяет увеличить число безвирусных растений с 40% до 80 - 100%.
Метод предполагает использование химических соединений - ингибиторов вирусов, которые добавляются в состав питательной среды. Наиболее часто для этих целей применяют 1 в - Д - рибофуранозил -1,2,4 - триазол - 3 карбоксимид (коммерческое название виразол). Виразол стерилизуется путем фильтрации и добавляется в охлажденную среду. Концентрации препарата зависят от вида растений (1 - 100 мг/л), длительность обработки подбирается эмпирически. По мере возрастания концентрации усиливается процесс элиминации вирусов, однако при концентрации выше 20-50 мг/ л уменьшается темп роста и может наблюдаться фитотоксический эффект. Виразол показал высокую эффективность при оздоровлении картофеля, черешни, сливы, малины, декоративных растений.
В Белорусском НИИ картофелеводства успешно испытан метод оздоровления посадочного материала картофеля на основе применения 2-5 - олигоаденилатов - соединений, относящихся к классу олигонуклеотидов и являющихся посредниками противовирусного действия интерферона. Для 2-5 - олигоаденилатов обнаружен большой спектр биологической активности, включая противовирусную, фитостимулирующую, цитокинино подобную и др (Калашникова Е. А. 2001).
Условия культивирования регенерантов
При выращивании культур клеток необходимо соблюдать внешние условия культивирования регенерантов при выращивании растений из черенков. Их сажают в пробирки с питательной средой, помещают в световую комнату и выращивают в благоприятных условиях, при температуре 25-28 єC, при 16 часовом фотопериоде, влажности воздуха 60-70% освещенности 2-5 тыс. лк (Кузьмина H. A. 2000).
Похожие статьи
-
Основное преимущество клонального микроразмножения - получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала. Предположение о возможности...
-
Для введения в культуру ткани растений у представителей рода Rosa L . в качестве исходного экспланта берут из верхушки энергично растущего побега, около...
-
Этапы микроклонального размножения растений - Клональное размножение и оздоровление растений
Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа: 1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной...
-
На эффективность микроклонального размножения влияет масса факторов различной природы. Это физиологические особенности вводимого в культуру растения,...
-
Выводы - Оздоровление и микроклональное размножение роз
В данной курсовой работе можно сделать несколько выводов. В первой главе этой работы мы познакомились с технологиями и техникой микроклонального...
-
Питательные среды, их состав, и приготовление - Оздоровление и микроклональное размножение роз
В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (плотные) среды. Жидкие среды используют для культивирования суспензий, каллусов, изолированных...
-
Присланный в лабораторию материал принимают и, по возможности, сразу же начинают исследовать, а, если это невозможно, то материал хранят до исследования...
-
Оборудование биотехнологической лаборатории Для организации биотехнологической лаборатории необходимы просторные изолированные помещения, а также...
-
Цели и задачи исследования Целью данной работы является разработка метода укоренения микрорастений сортов земляники садовой ex vitro, то есть в...
-
Подготовка семян к посеву - Технология возделывания гречихи на зерно
Для Посева гречихи в каждом хозяйстве рекомендуется использовать не менее двух рекомендованных сортов, отличающихся по длине вегетационного периода со...
-
Методы клонального микроразмножения - Клональное размножение и оздоровление растений
Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году,...
-
Технология оздоровления от вирусных инфекций Метод основан на способности растения к регенерации отсутствующих органов. Из отдельных частей почки...
-
Введение - Оздоровление и микроклональное размножение роз
Роза клональный эксплант растительный Микроклональное размножение растений - один из способов вегетативного размножения в условиях in vitro. Клональным...
-
Наиболее широко используют при работе с КК растворы Хенкса и Эрла, которые готовят на бидистиллированной воде с добавлением различных солей и глюкозы....
-
Картофель - растение умеренно прохладного климата с относительно высокой влажностью воздуха. В Северном полушарии Евразии его выращивают в основном между...
-
Биологические особенности картофеля Картофель (Solanum tuberosum) - это однолетнее травянистое растение. вырастающее до 100 сантиметров в высоту и...
-
Подготовка семян древесных пород к посеву - Лесное хозяйство в Республике Казахстан
По быстроте прорастания после высева в грунт все семена можно разделить на 4 группы: Быстро прорастающие семена, которые прорастают за 7-20 дней и при...
-
Молоко представляет идеальную питательную среду для микробов. При благоприятных условиях микробы в молоке быстро размножаются, вызывая его порчу. Очень...
-
Посадочный материал земляники получают на специальных маточных плантациях, которые закладывают в защищенном грунте по определенной схеме на почвенном...
-
При обмолоте зерно сразу очищают от сорняков и других примесей на ворохоочистительных машинах, при необходимости сушат до влажности 14-15%, затем...
-
Введение - Клональное размножение и оздоровление растений
Ускорение и облегчение селекционного процесса, а также создание растений с новыми качествами - это направления, которые достаточно успешно развиваются с...
-
Лен-долгунец - Linum usitatissimum (elongata) - однолетнее растение. Продуктивной его частью служит тонкий, прямой, светло-зеленый гладкий стебель,...
-
Предпосевная подготовка семян. - Оценка хозяйства ОАО СельпромМаш
Бахчевые (арбуз, дыня, кабачок, тыква). Семена сортируют. Помещают в кадки, заливают не 2-3 часа водой комнатной температуры или подогретой и...
-
Лен относится к числу лучших прядильных культур. Его возделывают главным образом для получения натурального волокна, а также семян, из которых отжимают...
-
Отбор и оценка селекционного материала Урожай зерна с единицы площади посева, наряду с продуктивностью зерна растения, находится в тесной зависимости от...
-
Значительное увеличение производства и применения минеральных удобрений, особенно азотных (аммиачной, натриевой и калиевой селитр, мочевины, аммиака), с...
-
Особенности посева (посадки) чечевицы на зерно в Радищевском районе Ульяновской области Сроки посева Способы посева, ширина междурядий, см Норма высева...
-
Обычно состоит из нескольких пассажей. После того, как образуется конгломерат растеньиц, он разделяется на одиночные микророзетки и они помещаются на...
-
Условия освещения и температура - Анализ проблемы укоренения сортов земляники садовой ex vitro
Для микропобегов, культивируемых на среде, содержащей сахарозу, не нужен вовсе или нужен слабый фотосинтез, однако определенное освещение - необходимый...
-
Подготовка почвы для смородины Особое значение имеет предпосадочная подготовка почвы. Она заключается в использовании лучших предшественников, заправке...
-
Таблица №3 Потребность в семенах и посадочном материале Наименование культуры Наименование сорта (гибрида) Площадь поля, Га Схема и способ посева,...
-
Какие культуры относят к масличным - Масличные культуры
В группу масличных входят растения, плоды или семена которых служат источником получения жирных масел. Иногда маслосодержащие плоды их употребляют и пищу...
-
Обезболивание - Кастрация свинки
Прежде чем оперировать животное, необходимо позаботиться о безопасности и безболезненности манипуляций. Для этого животному проводят общее или местное...
-
Помет является побочным продуктом в птицеводстве. Это ценное органическое удобрение. В то же время помет в птичнике является фактором загрязнения среды и...
-
Появление картофеля в России связывают с петровской эпохой. - Свойства картофеля
Один из основоположников научного картофелеводства в России агроном А. Т. Болотов, в 1770г опубликовал работу "Примечание о картофеле, или земляных...
-
Биологические особенности картофеля - Возделывание картофеля
Весь период роста картофеля условно разделяют на 3 периода. Первый период - от всходов до начала цветения. На этом этапе главным образом увеличивается...
-
Таблица № 6 Система орошения полевых культур в севообороте № Наименование культуры Виды поливов Сроки поливов Норма полива /Га К-во поливов Оросительная...
-
В период практики на базе клиники применялись следующие группы препаратов: 1. Противопаразитарные средства: Ь Гельминтал Ь Мибельмакс Ь Пиро-стоп...
-
Ряска - перспективное овощное растение За последние 50 лет, рясковые рассматриваются как чрезвычайно ценный экспериментальный объект для...
-
Введение - Антибиотикочувствительность бактерий, выделенных при отитах собак
На сегодняшний день большой интерес представляет роль бактериальных биопленок в патологических процессах. Биопленки - сложные микробные сообщества,...
Подготовка растительного материала, стерилизация эксплантов, термотерапия и химиотерапия, Условия культивирования регенерантов - Оздоровление и микроклональное размножение роз