ИДЕНТИФИКАЦИЯ КОЛЛЕКЦИОННЫХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ СОВРЕМЕННЫМИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМИ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ - Идентификация коллекционных культур бактерий современными масс-спектрометрическими и молекулярно-генетическими методами

В работе было использовано 45 (204, 205, 207, 210, 222, 223, 224, 250, 251, 3.15, 3.16, 3.17, 3.25, 3.26, 3.28, 3.58, 3.59, 3.70, 3.74, 3.73, 3.76, 3.92, 3.93, 3.127, 3.128, 3.129, 3.130, 3.131, 3.132, 3.134, 3.135, 38137, 38140, 38152, 38154, 38157, 38166, 38191, 38273, 38678, 38604, 38678, 38447, 38724, 41138) штаммов из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г. К. Скрябина РАН и 12 (№1, №3, №7, №6, 8(Р9), К5, К8, №4, Р20, PD4, №5, №2) штаммов из музея коллекционных культур кафедры генетики, микробиологии и биотехнологии. Были изучены культуральные и морфологические признаки, получены МАЛДИ масс-спектры и определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов 16S рРНК.

У всех 57 штаммов изучены морфологические и культуральные признаки (таблица 2).

Таблица 2 - Морфологическая и культуральная характеристика штаммов

Номера

Штаммов

Источник выделения

Культуральные

Особенности

Морфология

204,205,210,222, 223

Почва, Колымская низменность

Белесые, гладкие, вязкие, Г +

Палочки неправильной формы, V-формы

250,207

Почва, Колымская низменность

Бесцветные, гладкие, Г +

Кокки, располагающиеся парами, палочки неправильной формы

224

Почва, Колымская низменность

Белесые, гладкие, Г +

Палочки с булавовидными концами

251

Почва, Колымская низменность

Блестящие, гладкие, Г +

Кокки, образующие скопления неправильной формы

8(Р9)

Краснодарский край

Бесцветные, Г +

Длинные прямые и короткие палочки, подвижные, споры

Р20

Краснодарский край

Белесые, Г ?

Длинные палочки

PD4

Краснодарский край

Бесцветные, Г ?

Прямые палочки

K8

Краснодарский край

Красные, гладкая поверхность, Г +

Палочки неправильной формы

K5

Краснодарский край

Розовато-оранжевые, Г ?

Очень короткие палочки

3.15

Колымская низменность

Бесцветнее, Г +

Палочки, подвижные

3.16

Колымская низменность

Белесые, Г +

Палочки неправильной формы

3.17

Колымская низменность

Прозрачные, Г +

Палочки, обнаружены споры

3.25 , 3.26

Колымская низменность

Светло-желтые, Г +

Короткие палочки с закругленными концами

3.28

Колымская низменность

Белесые, Г ?

Короткие палочки и кокки

3.59, 3.70, 3.74

Колымская низменность

Желтые, Г ?

Палочки

3.73

Колымская низменность

Бежевые, Г ?

Короткие палочки

3.76

Колымская низменность

Желтые, Г +

Кокки, гроздевидное расположение

№1

Краснодарский край Нефтезагрязненный грунт

Белесые, шероховатые, Г +

Короткие палочки

№3

Краснодарский край Нефтезагрязненный грунт

Розовые, маслянистые,

Г +

Присутствуют палочки и кокки

№7

Краснодарский край Нефтезагрязненный грунт

Белесые, гладкие, вязкие, Г +

Присутствуют кокки

№2, №4

Краснодарский край

Белесые, Г ?

Короткие палочки, подвижные

№5

Краснодарский край

Безцветные, Г ?

Короткие палочки

№6

Краснодарский край

Розовые, пористая поверхность, Г ?

Короткие ровные палочки

38137

Почва, луг, Саратовская обл.

Белесые, блестящие, при пересеве - шероховатые, воздушный мицелий, Г +

Фрагменты мицелия, отдельные палочки.

38140

Почва, луг, Саратовская обл.

Белесые, гладкие блестящие, воздушный мицелий, Г +

Слабо фрагментированный мицелий.

38152, 38157

Чернозем, Ростовская обл.

Белесые, матовые, шероховатые, воздушный мицелий, Г +

Фрагменты мицелия, мало отдельных клеток.

38154

Чернозем, Ростовская обл.

белесые, блестящие, Г +

Фрагменты мицелия, V-формы.

38166

Почва, Волгоградская обл.

Белесые, гладкие, блестящие, воздушный мицелий, Г +

Фрагменты мицелия, мало отдельных клеток.

38191

Почва, Серпухов, Московская обл.

Белесые, гладкие, воздушный мицелий, Г +

Хорошо развитый

Мицелий.

38678

Почва, Южный Урал

Белесые, блестящие, воздушный мицелий, Г +

Лизированный мицелий, фрагменты мицелия.

38604, 38273, 38447

Почва, берег р. Кубань, Краснодарский край

Белесые, шероховаты, матовые, воздушный мицелий, Г +

Фрагменты мицелия.

38724

Почва, Южный Урал

Белесые, гладкие, блестящие, воздушный мицелий, Г +

Слабо фрагментируемый мицелий, отдельных клеток мало.

41138

Почва, лесополоса, ст. Старо-Минская, Краснодарский край, 2002

Белесые, шероховатые, воздушный мицелий, Г +

Фрагменты мицелия, тонкий мицелий, мало отдельных клеток.

3.92

Колымская низменность

Белесые, Г ?

Короткие палочки, подвижные

3.93

Колымская низменность

Белесые, гладкие, вязкие, Г +

Палочки неправильной формы, V-формы

3.127

Колымская низменность

Бесцветные, Г +

Длинные прямые и короткие палочки, подвижные

3.128

Колымская низменность

Белесые, Г ?

Палочки, подвижные

3.129

Колымская низменность

Кремовые, гладкие, Г ?

Палочки

3.130

Колымская низменность

Кремовые, гладкие, Г ?

Палочки с суженным центром

3.131

Колымская низменность

Белесые, гладкие, Г ?

Палочки

3.132

Колымская низменность

Безцветные, Г ?

Короткие палочки

3.134

Колымская низменность

Белесые, Г ?

Палочки

3.135

Колымская низменность

Светло-желтые, Г +

Короткие палочки с закругленными концами

Для идентификации штаммов методом МАЛДИ (таблица 3) было взято 45 штаммов из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г. К. Скрябина РАН и 12 штаммов из музея коллекционных культур кафедры генетики, микробиологии и биотехнологии.

Таблица 3 - Результаты идентификации методом МАЛДИ масс-спектрометрии с использованием программы Biotyper 3.0 (Bruker).*

Номер анализируемого образца

Ближайший штамм из базы данных Bruker

Оценка значения

Описание

№7

Rhodococcus erythropolis

1.887

Вероятная идентификация до рода

№3

Rhodococcus erythropolis

1.836

Вероятная идентификация до рода

№1

Rhodococcus erythropolis

1.96

Вероятная идентификация до рода

№6

Ненадежная идентификация**

1.634

Ненадежная идентификация

№5

Acinetobacter schindleri

2.144

Безопасная идентификация до вида

K5

Gordonia rubripertincta

1.878

Вероятная идентификация до рода

К8

Dietzia maris

1.988

Вероятная идентификация до рода

№4

Pseudomonas mendocina

1.71

Вероятная идентификация до рода

№2

Pseudomonas kilonensis

1.758

Вероятная идентификация до рода

Р20

Pseudomonas stutzeri

1.849

Вероятная идентификация до рода

PD4

Pseudomonas sp.

1.707

Вероятная идентификация до рода

3.28

Roseomonas mucora

1.985

Вероятная идентификация до рода

3.59

Methylobacterium rhodesianum

1.874

Вероятная идентификация до рода

3.70

Methylobacterium extorquens

2.362

Идентификация до вида

3.73

Pseudomonas beteli

1.79

Вероятная идентификация до рода

3.74

Methylobacterium extorquens

2.002

Безопасная идентификация до вида

3.76

Staphylococcus epidermidis

2.111

Безопасная идентификация до вида

3.92

Pseudomonas stutzeri

2.359

Идентификация до вида

3.127

Bacillus firmus

2.161

Безопасная идентификация до вида

3.128

Providencia rettgeri

2.18

Безопасная идентификация до вида

3.130

Brevundimonas vesicularis

2.317

Идентификация до вида

3.131

Ненадежная идентификация

1.427

Ненадежная идентификация

3.132

Acinetobacter Iwoffii

1.837

Вероятная идентификация до рода
    * В таблице представлены выборочные данные ** Штаммы с ненадежной идентификацией в таблицу не включены

Метод МАЛДИ масс - спектрометрии ориентирован на идентификацию патогенных и условно - патогенных микроорганизмов, поэтому почвенные бактерии и близкие им виды в базе данных МАЛДИ находятся в меньшем количестве. Именно поэтому многие штаммы не были идентифициованы этим методом.

На основании спектров (приложение А), полученных методом МАЛДИ масс-спектрометрии, из всех исследуемых штаммов удалось идентифицировать до вида 10 штаммов и до рода 23 штамма. Данные штаммы отнесены в соответствии с современной филогенетической систематикой [Bergey Manuales, 2007] к следующим таксонам:

    3.70 , 3.74 - Methylobacterium extorquens, порядок Rhizobiales, класс Alphaproteobacteria; 3.92 - Pseudomonas stutzeri, порядок Pseudomonadales, класс Gammaproteobacteria; 3.130 - Brevundimonas vesicularis, порядок Caulobacterales, класс Alphaproteobacteria;

№5 - Acinetobacter schindleri, порядок Pseudomonadales, класс Gammaproteobacteria;

    3.15 - Bacillus Licheniformis, порядок Bacillales, класс Bacilli; 3.17 - Paenibacillus glucanolyticus, порядок Bacillales, класс Bacilli; 3.76 - Staphylococcus epidermidis, Bacillales, класс Bacilli; 3.127 - Bacillus firmus, порядок Bacillales, класс Bacilli; 3.128 - Providencia rettgeri, порядок Enterobacteriales, класс Gammaproteobacteria.

№1,№3, №7 - род Rhodococcus, порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria; К5 - род Gordonia, порядок Actinomycetales, род Gordonia, класс Actinobacteria;

К8 - род Dietzia, подпорядок Corynebacterineae, порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria;

№2, №4, P20, РD4, 3.73, 3.92 - род Pseudomonas, порядок Pseudomonadales, класс Gammaproteobacteria ;

    3.28 - род Roseomonas, порядок Rhodospirillales, класс Alphaproteobacteria; 3.59 , 3.70, 3.74 - род Methylobacterium, порядок Rhizobiales, класс Alphaproteobacteria; 3.132 , №5 - род Acinetobacter, порядок Pseudomonadales, класс Gammaproteobacteria; 3.15 , 3.127 - род Bacillus, порядок Bacillales, класс Bacilli; 3.130 - Brevundimonas vesicularis, порядок Caulobacterales, класс Alphaproteobacteria; 3.17 - род Paenibacillus, порядок Bacillales, класс Bacilli; 3.76 - род Staphylococcus, Bacillales, класс Bacilli; 3.128 - род Providencia, порядок Enterobacteriales, класс Gammaproteobacteria.

Штаммы: 204, 205, 207, 210, 222, 223, 224, 250, 251, 3.16, 3.25, 3.26, 3.58, 3.93, 3.129, 3.131, 3.134, 3.135, №6, 8(Р9), не удалось идентифицировать методом МАЛДИ, поэтому для дальнейшей их идентификации был использован сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК (таблица 4). По финансовым соображениям этот метод не мог быть использован для всех неидентифицированных штаммов. В связи с этим были отобраны штаммы, представляющие возможность пополнения коллекций микроорганизмов ВКМ и КубГУ.

Таблица 4 - Уровни сходства по генам 16S рРНК исследуемых штаммов с ближайшими типовыми штаммами

№ штамма

Род

Ближайший типовой штамм

% сходства

3.16

Janibacter sp.

Janibacter holey DSM 21601(T)

99.82

3.25

Microbacterium sp.

Microbacterium phyllosphaerae DSM 13468(T)

100.0

3.26

Microbacterium sp.

Microbacterium phyllosphaerae DSM 13468(T)

100.0

3.58

Sphingomonas sp.

Sphingomonas mucossima CP 173-2(T)

98.44

3.93

Arthrobacter sp.

Arthrobacter citreus DSM 20133(T)

99.83

3.129

Brevundimonas sp.

Brevundimonas halotolerans MCS 24(T)

99.81

3.131

Brevundimonas sp.

Brevundimonas vesicularis LMG 2350(T)

98.25

3.134

Belnapia sp.

Belnapia soli PB-K8(T)

99.09

3.135

Microbacterium sp.

Microbacterium hydrocarbonoxydans DSM 16089(T)

99.69

№6

Pseudomonas sp.

Pseudomonas stutzeri ATCC 17588(T)

98.77

8(P9)

Bacilus sp.

Bacilus beringensis BR035(T)

99.74

Таким образом, все указанные (таблица 4) коллекционные штаммы были идентифицированы до рода по генетическим признакам.

На основании результатов, полученных при анализе нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК (приложение Б) удалось систематизировать следующие штаммы: 3.16 - род Janibacter, порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria; 3.25, 3.26, 3.135 - род Microbacterium, порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria; 3.58 - род Sphingomonas, класс Alphaproteobacteria; 3.93 - род Arthrobacter, порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria; 3.129, 3.131 - род Brevundimonas, порядок Caulobacterales, класс Alphaproteobacteria; 3.134 - Belnapia, порядок Rhodospirillales, класс Alphaproteobacteria; №6 - род Pseudomonas, порядок Pseudomonadales, класс Gammaproteobacteria, 8(P9) - род Bacilus, порядок Bacillales, класс Bacilli.

Все идентифицированные до вида или рода штаммы переданы в коллекции ВКМ и КубГУ. Штаммы с ненадежной идентификацией, но изученными морфолого-культуральными свойствами, отнесены к классам Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Bacilli и подлежат дальнейшему исследованию с целью их систематизации.

Во всех исследуемых образцах было обнаружено большое микробное разнообразие представителей различных видов и родов. Изоляты из колымской низменности были представленные в основном актиномицетами

Похожие статьи




ИДЕНТИФИКАЦИЯ КОЛЛЕКЦИОННЫХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ СОВРЕМЕННЫМИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМИ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ - Идентификация коллекционных культур бактерий современными масс-спектрометрическими и молекулярно-генетическими методами

Предыдущая | Следующая