Микрометод определения активности протеиназ А. П. Алексеенко. - Влияние значений рН и температуры на активность ферментов
Предлагаемый микрометод определения активности протеолитических ферментов основан на измерении содержания аргинина в пептидах, освобождающихся при гидролизе протеиназами белковых субстратов. Содержание аргинина определяют с помощью стабилизированной и усовершенствованной реакции Сакагучи (хроматограмму погружают в 0.1% раствор 8-гидроксихинолина в ацетоне, высушивают на воздухе, опрыскивают раствором 0.2 мл Br2 в 100 мл 0.5 М NaOH; аргинин и другие гуанидины дают оранжево-красные пятна, тауромицин и гликоциамин - лишь временную окраску), позволяющей определить содержание аргинина в растворах трихлоруксусной кислоты после осаждения и удаления нерастворимых белков. Зная содержание аргинина в белковом субстрате и определяя его количество в перешедших в раствор пептидах, можно рассчитать процент гидролиза белкового субстрата изучаемыми протеиназами. В этом состоит главное преимущество метода, поскольку метод Ансона не дает возможности рассчитать процент гидролиза белка, атакуемого протеолитическими ферментами. Из всех существующих методов только метод Мура и Штейна позволяет определить процент гидролиза белковых субстратов, но он имеет ограниченное применение, поскольку требует предварительного проведения полного кислотного гидролиза как белка-субстрата, так и образовавшихся пептидов. В предложенной методике калибровочная кривая строится по растворам свободного аргинина. Введение в реакцию пептидов и белков в виде их биуретовых комплексов повысило чувствительность реакции Сакагучи с остатками аргинина и сделало ее такой же чувствительной, как и для свободного аргинина. В качестве белкового субстрата используют классический субстрат - гемоглобин и окисленный по Сангеру лизоцим. Этот низкомолекулярный белок, содержащий 12.7% аргинина прекрасно расщепляется пепсином (рвется около 30 связей).
Прежде чем приступить к определению активности ферментов в изучаемых тканевых субстратах, необходимо:
- 1. Определить зависимость активности от рН и выбрать оптимальную реакцию среды для проявления активности изучаемого фермента. 2. Построить график зависимости активности фермента от времени его инкубации с субстратом, выбрать для работы те сроки инкубации, при которых сохраняется линейная зависимость между величиной активности фермента и временем его инкубации. 3. Определить зависимость величины активности от концентрации белка в пробе. Выбрать такие концентрации фермента, при которых величина активности фермента была бы пропорциональна его концентрации. Следует учитывать, что в тканевых экстрактах и биологических жидкостях могут присутствовать ингибиторы протеолитических ферментов. При разведении пробы их концентрация снижается, а протеолитических - увеличивается. Определяя "фактор разведения", можно одновременно с подбором оптимальных условий для определения протеолитической активности выявить и наличие ингибитора. 4. При определении активности фермента необходимо работать при постоянной скорости ферментативной реакции, достигаемой при полном насыщении фермента субстратом, при так называемой максимальной скорости ферментативной реакции. В каждом отдельном случае максимальную скорость необходимо найти экспериментально, измерив активность препарата при разных концентрациях субстрата, при постоянных концентрациях белка и времени инкубирования.
Похожие статьи
-
Для целей определения ферментов могут быть использованы не только измерение поглощения света, но также измерения флюоресценции - спектрофлюорометрические...
-
Спектрофотометрические методы. - Влияние значений рН и температуры на активность ферментов
Спектрофотометрические методы основаны на поглощении света в определенных участках спектра многими соединениями, являющимися активными группами...
-
Активность ферментов - способность в разной степени ускорять скорость реакции. Активность выражают в: 1)Международных единицах активности - (МЕ)...
-
Пепсин и папаин относятся к одной из наиболее многочисленных групп ферментов - протеолитические ферменты (протеазы). Они принадлежат к классу гидролаз, к...
-
Метод основан на том, что содержащие - аминогруппу аминокислоты дают с нингидридом окрашенную производную - дикетогидриндилидендикетогидриндамин, а также...
-
Манометрические методы., Другие методы. - Влияние значений рН и температуры на активность ферментов
Эти методы используются при определении активности фермента в тех случаях, когда в исследуемых реакциях один из компонентов находится в газообразном...
-
Данный метод основан на следующих принципах. Гемоглобин подвергают воздействию пепсина, оставшийся гемоглобин осаждают трихлоруксусной кислотой....
-
Введение. - Влияние значений рН и температуры на активность ферментов
Ферменты, (от лат. fermentum - брожение, закваска) или энзимы, представляют собой высокоспециализированный класс веществ белковой природы, используемый...
-
Методы и способы определения серы и ее соединений - Сера в природе и организме человека
1. Гравиметрический метод. Метод основан на реакции взаимодействия сульфат-ионов с катионами бария, сопровождающееся образованием малорастворимого...
-
Принцип: гемоглобин окисляют в метгемоглобин окисляют железосинеродистым калием (красная кровяная соль); образующийся с ацетонциангидрином окрашенный...
-
Энзимодиагностика - Использование ферментов в медицинской практике в качестве лекарственных средств
Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях...
-
РОФ - функционально разнородная группа белков, способных быстро изменять свою концентрацию при различных нарушениях гомеостаза независимо от природы и...
-
Физиологическая роль белка, Структурная функция белка - Строение, функции и значение белков
Структурная функция белка Белки сложные органические соединения, построенные из аминокислот. В состав белковых молекул входят азот, углерод, водород и...
-
Ферменты (от латинского слова fermentum - закваска) - белки, которые обладают каталитической активностью и характеризуются очень высокой специфичностью и...
-
Пассивная устойчивость - Влияние температуры на жизненные процессы
Рассмотренные закономерности охватывают диапазон изменений температуры, в пределах которого сохраняется активная жизнедеятельность. За границами этого...
-
Механизмы терморегуляции - Влияние температуры на жизненные процессы
Физиологические механизмы, обеспечивающие тепловой гомеостаз организма (его "ядра"), подразделяются на две функциональные группы: механизмы химической и...
-
Аллостерическая регуляция. Фермент изменяет активность с помощью нековалентно связанного с ним эффектора. Связывание происходит в участке,...
-
Под влажностью сырья понимают потерю в массе за счет гигроскопической влаги и летучих веществ, которую определяют в сырье при высушивании до постоянной...
-
Эффект, оказываемый N-ADA на восстановление рефлекторной деятельности в постгипоксическом периоде оценивалась по уровню поведенческой активности животных...
-
Ферменты используют различные вещества для создания нашего организма. Но они могут не только созидать, но и разрушать уже построенное. Ферменты --...
-
Жизнь организма в целом, как и каждое проявление жизнедеятельности, необходимо связаны с расходованием энергии. Клеточное деление, рост, развитие и...
-
Подвижность воздуха возникает вследствие разницы температур на различных участках поверхности Земли. В гигиенической практике движение воздуха...
-
Температура и развитие - Влияние температуры на жизненные процессы
В наиболее генерализованной форме влияние температуры на обменные процессы прослеживается при изучении онтогенетического развития пойкилотермных...
-
Гормоны могут влиять на поведение, воздействуя на сенсорно-перцептивные механизмы, на активность нервной системы и на эффекторные механизмы, необходимые...
-
Влияние внутренних и внешних факторов на фотосинтез - Нуклеиновые кислоты и их структура
Фотосинтез осуществляется в полуавтономных органеллах - хлоропластах. Однако он в значительной мере контролируется процессами, происходящими в растении,...
-
Свойства ферментов - Питательные вещества
Важнейшим свойством ферментов является преимущественное одной из нескольких теоретически возможных реакций. В зависимости от условий ферменты способны...
-
Нефть - это жидкий природный раствор, состоящий из большого числа углеводородов (УВ) разнообразного строения и высокомолекулярных смолисто-асфальтеновых...
-
Для изучения влияния Цп на процессы генерации АФК фагоцитами в условиях in vitro использовали цельную кровь здоровых людей - доноров крови, так как...
-
Ферментативные методы, Микробиологические методы - Методы количественного определения витамина B6
Определение коферментных форм витамина В6 ферментативными методами основано на реакции взаимодействия фосфорилированных форм витамина -...
-
Получение бионаночастиц серебра методом химического восстановления в растворах Наночастицы серебра в водных растворах получают путем восстановления ионов...
-
Введение - Биологическая активность бионаночастиц серебра, полученных методом "Зеленого" синтеза
В последнее время интерес в развитии новых стратегий для формирования бионаночастиц серебра проистекает от их потенциального применения в различных...
-
Ферменты - Биология раневого процесса
Организм ведет постоянно борьбу с угрожающей ему интоксикацией ядовитыми продуктами распадающегося тканевого вещества посредством самых разнообразных...
-
Система определения некоторых факторов персистенции энтеробактерий
В настоящее время для определения безопасности пищи для организма человека необходима экспертиза питьевой воды и пищевых продуктов, произвести которую...
-
Спонтанную биоэлектрическую активность нейронов регистрировали с использованием мультиэлектродной системы MED64 и MEA60 при стандартных условиях...
-
Дія різних видів амілаз - Будова і властивості ферментів
Ферменти мають дуже високою специфічністю. Ця специфічність обумовлена особливою формою молекули ферменту, точно відповідній формі молекули субстрату. Цю...
-
Амілаза її види та будова - Будова і властивості ферментів
Амілази (грец. бmylon -- крохмаль) -- ферменти класу гідролаз, які забезпечують гідроліз б-1,4-глікозидних зв'язків у молекулах полісахаридів --...
-
Способи вираження активності ферментів - Будова і властивості ферментів
У біологічних об'єктах ферменти знаходяться в дуже мізерних концентраціях, тому для оцінки ферментативних процесів визначають не вміст ферментів, що...
-
Специфічність дії ферментів, Класифікація і номенклатура ферментів - Будова і властивості ферментів
Кожен ензим діє на певний субстрат або групу речовин, які подібні за своєю структурою. Специфічність дії ферментів пояснюється схожістю конфігурації...
-
Механізм дії ферментів - Будова і властивості ферментів
З'ясування механізмів, що лежать в основі каталітичного дії ензимів, є однією з фундаментальних завдань і актуальних проблем не тільки ензимології, а й...
-
Азотистое равновесие - Строение, функции и значение белков
Азотистое равновесие - это соотношение между количеством азота, содержащегося в принятой пище, и количеством азота, выведенного из организма. Если обе...
Микрометод определения активности протеиназ А. П. Алексеенко. - Влияние значений рН и температуры на активность ферментов