Определение протеолитических ферментов по Муру и Штейну. - Влияние значений рН и температуры на активность ферментов
Метод основан на том, что содержащие - аминогруппу аминокислоты дают с нингидридом окрашенную производную - дикетогидриндилидендикетогидриндамин, а также альдегид-аминокислоты и углекислоту.
Окрашенный продукт обладает характерным максимумом поглощения при 570 м, а интенсивность окраски зависит от количества аминокислоты. С пролином и оксипиролином реакция протекает в ином направлении, а максимум поглощения получаемого при этом окрашенного продукта расположен при 440 м.
Инкубацию фермента удобно проводить в мерных колбочках по 5 мл, в которых смешивают и уравновешивают при постоянной температуре на водяной бане все компоненты за исключением фермента. После этого добавляют фермент, раствор смешивают и берут пробы для исследования. Для кинетических измерений концентрацию фермента желательно подобрать таким образом, чтобы аликвотные части можно было бы брать каждые 5 минут.
Аликвотные части пробы, взятые сразу же после добавления фермента, а затем через соответствующие интервалы, добавляют в фотометрические пробирки, содержащие 2 мл реактива нингидрида - это тотчас обрывает реакцию. После этого смесь 20 мин. нагревают на водяной бане; полученная окраска устойчива минимум 24 часа. Средняя ошибка при анализе повторных проб составляет 2%. После разбавления кипяченой смеси пробы и нингидрида 10 мл смеси, состоящей из равных объемов воды и н. пропанола, интенсивность окраски определяют на спектрофотометре Колемана при 570 м.
Для калибровки пользуются постоянными количествами стандартных аминокислот, содержащих реакционные компоненты. При помощи калибровочных кривых, построенных отдельно для каждой исследуемой аминокислоты, измерения интенсивности окраски (по отношению к контрольной колбе) пересчитывают в миллимоли. При делении этих величин на миллимоли субстрата, использованного в процессе реакции, можно найти процент гидролиза.
Построение калибровочной кривой исключает ошибки, происходящие от качественных различий реакции аминокислот на цветной реактив. До оптической плотности 0.1 зависимость между величиной поглощения и количеством субстрата носит линейный характер.
Воспроизводимость составляет 3%. Мешающее влияние аммония, аминов и других веществ, содержащихся в биологическом материале и дающих цветную реакцию с нингидридом, исключается при помощи соответствующих холостых проб. Анализ сравнительно упрощается, когда изучают протеолитические ферменты, субстратами которых являются пептиды, не содержащие свободных аминогрупп. В этом случае вся образующаяся окраска целиком приходится на освободившуюся аминокислоту.
Похожие статьи
-
Для целей определения ферментов могут быть использованы не только измерение поглощения света, но также измерения флюоресценции - спектрофлюорометрические...
-
Спектрофотометрические методы. - Влияние значений рН и температуры на активность ферментов
Спектрофотометрические методы основаны на поглощении света в определенных участках спектра многими соединениями, являющимися активными группами...
-
Активность ферментов - способность в разной степени ускорять скорость реакции. Активность выражают в: 1)Международных единицах активности - (МЕ)...
-
Пепсин и папаин относятся к одной из наиболее многочисленных групп ферментов - протеолитические ферменты (протеазы). Они принадлежат к классу гидролаз, к...
-
Манометрические методы., Другие методы. - Влияние значений рН и температуры на активность ферментов
Эти методы используются при определении активности фермента в тех случаях, когда в исследуемых реакциях один из компонентов находится в газообразном...
-
Введение. - Влияние значений рН и температуры на активность ферментов
Ферменты, (от лат. fermentum - брожение, закваска) или энзимы, представляют собой высокоспециализированный класс веществ белковой природы, используемый...
-
Данный метод основан на следующих принципах. Гемоглобин подвергают воздействию пепсина, оставшийся гемоглобин осаждают трихлоруксусной кислотой....
-
Азотистое равновесие - Строение, функции и значение белков
Азотистое равновесие - это соотношение между количеством азота, содержащегося в принятой пище, и количеством азота, выведенного из организма. Если обе...
-
Физиологическая роль белка, Структурная функция белка - Строение, функции и значение белков
Структурная функция белка Белки сложные органические соединения, построенные из аминокислот. В состав белковых молекул входят азот, углерод, водород и...
-
Жизнь организма в целом, как и каждое проявление жизнедеятельности, необходимо связаны с расходованием энергии. Клеточное деление, рост, развитие и...
-
Аллостерическая регуляция. Фермент изменяет активность с помощью нековалентно связанного с ним эффектора. Связывание происходит в участке,...
-
Эффект, оказываемый N-ADA на восстановление рефлекторной деятельности в постгипоксическом периоде оценивалась по уровню поведенческой активности животных...
-
Витамины представляют собой группу веществ, которые необходимы для нормальной функции клеток, их роста и развития. Существует 13 основных витаминов,...
-
Подвижность воздуха возникает вследствие разницы температур на различных участках поверхности Земли. В гигиенической практике движение воздуха...
-
Пассивная устойчивость - Влияние температуры на жизненные процессы
Рассмотренные закономерности охватывают диапазон изменений температуры, в пределах которого сохраняется активная жизнедеятельность. За границами этого...
-
Обмен белков в организме человека - Строение, функции и значение белков
Важный критерий пищевой ценности белков - доступность аминокислот. Аминокислоты большинства животных белков полностью высвобождаются в процессе...
-
Краткая фармакологическая характеристика - Ферменты в гастроэнтерологии
Ацидин-пепсин - препарат, содержащий протеолитический фермент. Получают из слизистой оболочки желудка свиней. Таблетки по 0,5 и 0,25 г содержат 1 часть...
-
В зависимости от химической природы ферменты делятся на простые и сложные [11]: Простые ферменты состоят только из аминокислот - например, пепсин,...
-
Роль витаминов в построении ферментов
Витамины - это низкомолекулярные органические вещества самого разнообразного строения, которые не синтезируются в организме, но являются жизненно...
-
Ферменты используют различные вещества для создания нашего организма. Но они могут не только созидать, но и разрушать уже построенное. Ферменты --...
-
Процесс митоза обеспечивает строго равномерное распределение хромосом между двумя дочерними ядрами, так что в многоклеточном организме все клетки имеют...
-
Человеческий организм - это большие часы. Каждый процесс в которых должен регултроваться и не выходить из под контроля. Незаменимой шестеренкой в этих...
-
Влияние температуры на организм - Влияние температуры на организм
Температура -- важнейший из ограничивающих (лимитирующих) факторов. Пределами толерантности для любого вида являются максимальная и минимальная летальные...
-
Механизмы терморегуляции - Влияние температуры на жизненные процессы
Физиологические механизмы, обеспечивающие тепловой гомеостаз организма (его "ядра"), подразделяются на две функциональные группы: механизмы химической и...
-
Дія різних видів амілаз - Будова і властивості ферментів
Ферменти мають дуже високою специфічністю. Ця специфічність обумовлена особливою формою молекули ферменту, точно відповідній формі молекули субстрату. Цю...
-
Амілаза її види та будова - Будова і властивості ферментів
Амілази (грец. бmylon -- крохмаль) -- ферменти класу гідролаз, які забезпечують гідроліз б-1,4-глікозидних зв'язків у молекулах полісахаридів --...
-
Физиологическое значение вкуса - Анализаторы пищи
Сигнал от вкусовых рецепторов используется организмом двояко. Во-первых, бессознательно - например, для управления желудочной секрецией, причем как ее...
-
Состав ферментных препаратов - Ферменты в гастроэнтерологии
При нарушении пищеварения применяются различные лекарственные средства, содержащие ферменты. В зависимости от состава ферментные препараты можно...
-
Исследование цветоощущения - Определение цветовой остроты зрения
Согласно трехкомпонентной теории цветового зрения М. Ломоносова в зрительном анализаторе допускается существование трех видов цветоощущающих компонентов,...
-
Ферменты - Биология раневого процесса
Организм ведет постоянно борьбу с угрожающей ему интоксикацией ядовитыми продуктами распадающегося тканевого вещества посредством самых разнообразных...
-
Способи вираження активності ферментів - Будова і властивості ферментів
У біологічних об'єктах ферменти знаходяться в дуже мізерних концентраціях, тому для оцінки ферментативних процесів визначають не вміст ферментів, що...
-
Специфічність дії ферментів, Класифікація і номенклатура ферментів - Будова і властивості ферментів
Кожен ензим діє на певний субстрат або групу речовин, які подібні за своєю структурою. Специфічність дії ферментів пояснюється схожістю конфігурації...
-
Брожение - процесс анаэробного расщепления органических веществ, преимущественно углеводов, происходящий под влиянием микроорганизмов или выделенных из...
-
Влияние внутренних и внешних факторов на фотосинтез - Нуклеиновые кислоты и их структура
Фотосинтез осуществляется в полуавтономных органеллах - хлоропластах. Однако он в значительной мере контролируется процессами, происходящими в растении,...
-
Введение - Строение, функции и значение белков
Важнейшим компонентом питания являются белки. Белки представляют основу структурных элементов клетки и тканей. С белками связаны основные проявления...
-
Свойства ферментов - Питательные вещества
Важнейшим свойством ферментов является преимущественное одной из нескольких теоретически возможных реакций. В зависимости от условий ферменты способны...
-
В каждом организме (животном, растительном или микробной клетке) все время происходят сложные процессы превращения веществ. Велика роль в этих процессах...
-
ОПРЕДЕЛЕНИЕ В ПОЧВЕ БАКТЕРИЙ - Анализ микрофлоры почвы
Из первого разведения почвенной суспензии (1 : 10) берут 10 мл и засевают во флаконы с 50 мл жидких сред (Кес-слера или лактозного бульона с...
-
Субклеточные изменения при повреждении клеток - Функциональная морфология клетки
Лизосомы содержат различные гидролитические ферменты -- кислую фосфатазу, глюкуронидазу, сульфатазу, рибонуклеазу, коллагеназу и др. Эти ферменты...
-
Обмен белков - Питательные вещества
После расщепления белков в пищеварительном тракте образовавшиеся аминокислоты всасываются в кровь. В кровь всасывается также незначительное количество...
Определение протеолитических ферментов по Муру и Штейну. - Влияние значений рН и температуры на активность ферментов