Специальные методы определения активности пепсина и папаина., Модификационный метод. - Влияние значений рН и температуры на активность ферментов

Пепсин и папаин относятся к одной из наиболее многочисленных групп ферментов - протеолитические ферменты (протеазы). Они принадлежат к классу гидролаз, к подклассу пептидгидролаз и катализируют расщепление белков и полипептидов в соответствии с уравнением:

R1CONHR2 + H2O + R1COOH + H2NR2 , R1 и R2 - остатки аминокислот, ди - или полипептиды.

Т. е. протеазы катализируют расщепление пептидной связи ѕCOѕNHѕ

Методы определения активности протеолитических ферментов.

Модификационный метод.

Модификационный метод с применением субстрата казеина основан на определении скорости ферментативной реакции гидролиза субстрата под действием исследуемых протеолитических ферментов, содержащихся в материале, взятом на анализ. Скорость реакции определяют по количеству образовавшихся аминокислот - тирозина (-амино--оксифенилпропионовая кислота) и триптофана (-амино--индолилпропионовая кислота), которые устанавливают колориметрической реакцией с реактивом Фолина. Этим методом определяют указанные аминокислоты как в свободном, так и в связанном состоянии.

По количеству тирозина и триптофана, содержащемуся в гидролизате, определяют количество превращенного белка в процессе ферментативной реакции (из расчета содержания в белке 6% тирозина и 1.8% триптофана). В основу расчета активности протеолитических ферментов положена зависимость степени гидролиза белка от числа единиц активности фермента, введенных в ферментативную реакцию. На основе этой зависимости составляется график.

Поскольку в данном методе количество аминокислот, характеризующих количество превращаемого белка, определяется по интенсивности окраски реакционных сред - оптической плотности после реакции с реактивом, то в графике для простоты расчета вместо количества превращенного белка ставится пропорциональная ему оптическая плотность раствора. При составлении графика по оси абсцисс откладывают число единиц фермента, введенное в ферментативную реакцию, а по оси ординат - оптическую плотность, полученную после колориметрической реакции с реактивом Фолина.

    А) Содержание белка, мг б) Единицы активности А) Зависимость оптической плотности от количества превращенного в процессе ферментативной реакции белка. Б) Зависимость оптической плотности от числа единиц активности протеолитических ферментов.

Относя количество введенных в реакцию единиц активности фермента к действию 1 г препарата, определяют его активность. Для расчета прямой, изображенной на графике, составляет расчетное уравнение.

За единицу протеолитической активности принято такое количество фермента, которое катализирует за 30 минут гидролиз 1 г белка в принятых условиях до продуктов, не осаждающихся трихлоруксусной кислотой. 1г составляет 25% от взятого на ферментативную реакцию белка.

Протеолитическая активность характеризуется числом единиц активности фермента, содержащегося в 1 г препарата и твердых полупродуктов или в 100 мл жидких материалов. Метод предназначен для анализа очищенных ферментных препаратов грибного происхождения и всех полупродуктов, получающихся при их производстве.

Похожие статьи




Специальные методы определения активности пепсина и папаина., Модификационный метод. - Влияние значений рН и температуры на активность ферментов

Предыдущая | Следующая