Методы исследования обмена веществ - Основы биоэнергетики

В современных биохимических исследованиях широко используют такие методы как Хроматография, Рентгеноструктурный анализ, ЯМР-спектроскопия, Электронная микроскопия, сканирующая зондовая микроскопия. Методы изучения процессов метаболизма можно подразделить на две основные группы:

    - методы изучения метаболизма на Целых организмах; - Аналитически-дезинтегрирующие методы.

Изучение процессов метаболизма на Целом организме. Ранее использовали определение концентрации выделения конечного продукта при введении предполагаемых промежуточных метаболитов. Например, в опытах на животных с экспериментальным диабетом, было установлено, что введение таких аминокислот, как Ala, Ser, Glu, вызывает еще более усиленное выведение глюкозы с мочой. На этом основании было сделано заключение, что эти аминокислоты могут служить метаболическими предшественниками глюкозы. В настоящее время с этой целью применяются Изотопы (Меченые атомы).

Обычно используются либо:

    - Стабильные изотопы элементов, отличающихся по массе от широко распространенных в организме элементов (Тяжелые изотопы). Из них чаще используют:
      O Изотопы водорода с массой 2 (Дейтерий, 2Н), O Азот с массой 15 (15N), O Углерод с массой 13 (13С) и O Кислород с массой 18 (180);
    - Радиоактивные изотопы. Из радиоактивных изотопов применяются: O изотопы Водорода (Тритий, 3Н), O Фосфора (32Р и 33Р), O Углерода (14С), O Серы (35S), O Йода (125I), O Железа (59Fe), O Натрия (24Na) и др.

Радионуклид

Период полураспада

3H (тритий)

12.43 года

14C

5730 лет

32P

14.3 дней

33P

25.4 дней

35S

87.4 дней

125I

60 дней

Пометив при помощи стабильного или радиоактивного изотопа молекулу исследуемого соединения и введя его в организм, определяют затем меченые атомы или содержащие их химические группы в определенных соединениях и делают заключение о Путях превращения меченого вещества в организме.

С помощью Изотопного метода можно установить:

    - локализации, места накопления и пути транспорта иследуемых веществ; - Время пребывания вещества в организме, которое характеризует Период его полураспада, Т. е. время, за которое количество изотопа или меченого соединения уменьшается вдвое, - получить точные сведения относительно Проницаемости мембран; - изучать процессы синтеза полимеров (скорость, локализацию, участие субстратов) (белков); - изучать пути метаболизма, чтобы установить, является ли данное вещество предшественником или продуктом распада другого соединения. - Наконец, при существовании нескольких путей обмена веществ можно определить, какой из них превалирует.

Аналитически-дезинтегрирующие методы. Принцип этих методов состоит в поэтапном упрощении, сложной биологической системы с целью изолирования отдельных ее частей. В нисходящей последовательности, их можно расположить в следующем порядке:

    - Удаление отдельных органов (В частности, путем изучения перфузата в опытах с изолированными органами было установлено, что печень служит главным местом образования кетоновых тел и мочевины); - Метод тканевых срезов и клеточных культур (С помощью такой методики на аппарате Варбурга было изучено тканевое дыхание (потребление кислорода и выделение углекислого газа тканями); - Получение гомогенатов и субклеточных фракций (Разрушение клеточных мембран делает возможным непосредственный контакт между содержимым клетки и добавленными соединениями. Это дает возможность установить, какие ферменты, коферменты и субстраты имеют значение для исследуемого процесса. Применение метода дифференциального центрифугирования гомогенатов позволяет изучать процессы обмена веществ, связанные с различными органеллами клетки (митохондриями, лизосомами, рибосомами, ядром и др. Например, для изучения путей и механизмов синтеза белка используют изолированные рибосомы, а для исследования окислительных реакций цикла Кребса или цепи дыхательных ферментов служат митохондрии), - частичная или полная реконструкция ферментной системы In vitro с использованием ферментов, коферментов и других компонентов реакции.

Похожие статьи




Методы исследования обмена веществ - Основы биоэнергетики

Предыдущая | Следующая