Определение прочностных характеристик, Испытания на биосовместимость - История создания и развития биоматериалов

В работе исследовали прочность при растяжении методом диаметрального сжатия цилиндрических образцов (Рис. 11). Испытания проводили на испытательной машине UTS-100 (Testsysteme GmbH) в соответствии со стандартом ASTM C 1161. Расчет прочности при испытании цилиндрических образцов производили по формуле:

У=2Р/рdh,

Где у - прочность при растяжении, МПа;

Р - разрушающая нагрузка, Н;

D - диаметр образца, мм;

H - высота образца, мм.

форма, винты и зажим для приготовления образцов для испытания прочности на сжатие

Рис.11 Форма, винты и зажим для приготовления образцов для испытания прочности на сжатие

Испытания на биосовместимость

Эксперименты на биосовместимость выполнены в ФГУ Московском научно - исследовательском онкологическом институте им П. А. Герцена.

Эксперименты in vitro по оценке острой цитотоксичности материалов и динамки нарастания на них клеток выполнены на модели клеточной линии иммортализованных нормальных фибробластов человека (ФЧ), полученной из Коллекции Типовых Клеточных культур Медико-Генетического научного центра РАМН, г. Москва.

Клеточную линию поддерживали в полной ростовой среде (ПРС) следующего состава: среда ДМЕМ (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова, РАМН, Москва), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ФУРО, Москва), глютамин (600 мг/л), гентамицин (50 мкг/мл).

В экспериментах использовали клетки в логарифмической фазе роста (предконфлюэнтный монослой).

Для получения суспензии одиночных клеток монослой ФЧ обрабатывали 0,25% раствором трипсина (Sigma, США), затем полученную взвесь клеток тщательно дважды отмывали центрифугированием в большем объеме ПРС, производили их подсчет и оценку жизнеспособности, окрашивая клеточную суспензию 0,04% раствором трипанового синего.

Затем в платы с подготовленными образцами ПКМ (опыт) и без них (контроль) помещали ФЧ (70 тыс. кл. на лунку) в объеме 200 мкл ПРС и инкубировали: для определения острой цитотоксичности в течение 24 часов, для оценки матриксных свойств пористых структур на основе хитозана и фосфатов кальция - 7, 14, 28, 56 и 112 и 180 суток.

Полную замену ПРС осуществляли до 7-х суток эксперимента дважды в неделю, далее, вплоть до окончания опыта, - ежедневно. Все операции осуществляли в стерильных условиях, культивирование - в атмосфере влажного воздуха, содержащего 5% СО2, при 370С.

Жизнеспособность в динамике эксперимента оценивали с помощью МТТ метода, который основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать 3-(-4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромистый (МТТ, Sigma, США) в голубые кристаллы формазана, нерастворимые в воде.

Количество образовавшегося формазана может характеризовать пролиферативную активность (жизнеспособность/количество) различных клеток человека и животных.

Для проведения МТТ-теста в опытах in vitro по окончанию культивирования на культуральном пластике-полистерене (контроль) и на образцах из каждой лунки отбирали по 100 мкл среды и вносили по 25 мкл раствора МТТ в концентрации 5 мг/мл.

Через 3 часа инкубации (5% СО2, 370 С) из каждой лунки полностью декантировали ПРС и осуществляли растворение образовавшегося формазана с помощью изопропилового спирта (200 мкл на лунку).

От осадка, образующегося в результате преципитации белков в изопропаноле, освобождались центрифугированием плат в течение 10 мин. при 3000 об/мин. Далее из каждой лунки переносили по 100 мкл супернатанта в 96-луночный плоскодонный планшет (Сostar, США) и оценивали оптическую плотность раствора формазана на спектрофотометре МСС-340 (Швеция) при длине волны 540 нм.

В качестве спектрофотометрических контролей (бланк) использовали пробы с чистой ПРС и пробы, содержащие тестируемые образцы в ПРС (без клеток).

Для определения цитотоксичности материалов рассчитывали пул жизнеспособных клеток через 24 часа инкубации с ними по формуле:

ПЖК= ОПопыт/ОПконтр *100% (3)

Где: - ОП - оптическая плотность раствора формазана

- ПЖК - пул жизнеспособных клеток

При оценке матриксных свойств пористых материалов на основе хитозана определяли изменение пула ( Д ) в конкретный срок по формуле:

Д =(ОПнаст - ОПпред)/ ОПпред *100% (4)

ОПнаст. - величина оптической плотности в конкретный срок;

ОП пред. - величина оптической плотности в предыдущий срок.

Похожие статьи




Определение прочностных характеристик, Испытания на биосовместимость - История создания и развития биоматериалов

Предыдущая | Следующая