Оценка районированных сортов зерновых культур для целей сертификации семенного материала

Введение

Проблема точной оценки сортового качества семенного материала является одной из наиболее актуальных в современном сельскохозяйственном производстве. От того, насколько точно и объективно будет проведена процедура идентификации и оценки сортовой чистоты, зависит не только получение продукции запланированного сельскохозяйственным производителем объема и качества, но и гарантия обеспеченности прав авторов сортов, гарантия исключения фальсификации при реализации семенного материала. Правильно проведенные процедуры сортовой идентификации в системе мер сертификации гарантируют качество семян, способствуют защите интеллектуальных прав патентообладателя и дают возможность потребителю товарной продукции получать сырье с требуемыми характеристиками, носителем которых является конкретный сорт. Все это свидетельствует о необходимости применения методов, обладающих, во-первых, объективностью результатов, во-вторых, наименее зависимых от воздействия каких-либо внешних факторов, в - третьих, экономически целесообразных для значительных объемов торгового оборота семян на современном этапе. В полной мере данным требованиям в настоящее время отвечают методы молекулярных маркеров, а именно метод, основанный на оценке запасных белков семян. Правомерность и надежность данного метода подтвердило включение его в систему сертификации семенного материала в Российской Федерации [1] и Республике Беларусь и актуализация в рамках Государственного стандарта [2]. Для унификации результатов, получаемых в профильных лабораториях ГУ "Главная государственная инспекция по семеноводству, карантину и защите растений", создания единой базы эталонных (аутентичных) белковых спектров и сортовых формул всех районированных в Республике Беларусь сортов была проведена работа по созданию комплексного каталога, имеющего возможность к практическому применению в системе сертификации.

Анализ источников.

Для регистрации сортов, охраны прав селекционеров традиционно используется ряд методов, базирующихся на оценке комплекса морфологических признаков сорта. Одним из таких методов для стран, являющихся участниками Международного союза по защите новых сортов растений, в том числе и для Республики Беларусь, служит DUS-тест по критериям новизны, отличимости, однородности и стабильности [3]. Одним из ведущих компонентов DUS-теста является критерий отличимости, который оценивают как явное качественное отличие нового сорта от уже существующего хотя бы по одному признаку. В системе семеноводства используется целый ряд методов для контроля и сохранности качества семян, оцениваемых путем проведения сортового контроля на основе комплекса наследственно закрепленных фенотипических признаков _ апробация, грунт-контроль, лабораторный сортовой контроль. Вместе с тем, несмотря на объективность и надежность данных методов контроля, результатов, получаемых на их основе, нередко недостаточно для однозначной идентификации сорта, оценки его сортовых качеств по причине модификационной изменчивости морфологических признаков, фенотипического сходства генетически близких сортов. Кроме этого, наиболее информативные и точные из данных методов характеризуются двумя основными недостатками - используются или в определенные фазы развития растений (апрбация), или являются высокозатратными по времени проведения (грунт-контроль).

Начиная с 1922 г. деятельность в области сортового контроля сосредотачивается в структуре ISTA (Международная ассоциация по испытанию семян). Статья 3 Конституции ISTA определяет первоочередную задачу данной организации в виде разработки, утверждения и актуализации стандартных процессов (методов) отбора образцов и испытания семян, а также обеспечение единообразного применения таких процессов для оценки семян в международном масштабе [4].

В 1980 г. методы, разработанные в Российской Федерации Всероссийским научно-исследовательским институтом растениеводства им. Н. И. Вавилова (ГНЦ РФ ВИР) по белкам в области сортовой идентификации, были рекомендованы 19-м конгрессом ISTA к использованию в семеноводстве и семенном контроле [4].

Электрофоретический анализ запасных белков зерна, как универсальный метод контроля качества семенной продукции, незаменим при осуществлении международной торговли. Основанный на научных достижениях молекулярной биологии и генетики, он позволяет наиболее точно определять качество семян на генетическом уровне вне зависимости от условий среды развития растений [5,6].

Идентификация сортов, линий и гибридов сельскохозяйственных растений является неотъемлемым элементом селекции и семеноводства. Она обеспечивает защиту авторских прав селекционных учреждений, позволяет следить за чистотой сорта и соответствием его известному стандарту (аутентичному образцу) [7]. Для большинства культур уже составлены эталонные спектры (т. е. суммарные спектры, полученные на основе сравнительного анализа спектра запасных белков, выявленных на большом количестве сортов конкретной культуры) [8].

Для этих целей востребовано создание каталогов, которые включают полную информацию об электрофоретических спектрах сортов в форме справочного материала для целей выявления принадлежности к сорту, выяснения, каким сортом засорены семена при оценке сортовой чистоты.

Большая работа по составлению биохимических паспортов в части наследования компонентов белковых спектров была проведена в Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова Российской академии наук [9, 10, 11]. На пшенице подобные исследования велись в более широком масштабе. Еще в 1980 г. были созданы каталоги блоков глиадинкодирующих аллелей на основе электрофореза белков в крахмальном геле [12]. Е. В. Метаковским [13] был составлен подобный каталог для озимой пшеницы на основе результатов применения стандартного полиакриламидного геля с модификациями.

Методы исследования.

В качестве объекта исследований выступали оригинальные образцы сортов пшеницы (озимой, яровой твердой и мягкой) и тритикале (яровой и озимой), включенные в Реестр сортов и древесно-кустарниковых пород [14].

Оценка семян зерновых культур, создание эталонных электрофоретических спектров, сортовых белковых формул проводились на базе Испытательной лаборатории качества семян УО БГСХА, соответствующей критериям системы аккредитации Республики Беларусь и международным требованиям по СТБ ИСО / МЭК 17025-2007.

Проведение электрофоретического анализа глиадинов, идентификации и интерпретации результатов полученных белковых спектров осуществляли согласно модифицированной методике определения [15].

Для получения электрофоретических белковых спектров были использованы пробы оригинальных семян, полученные от филиала Национального генетического фонда хозяйственно-полезных растений при УО БГСХА, лаборатории генетических ресурсов культурных растений РУП "Научно-практический центр НАН Беларуси по земледелию", ряда учреждений - оригинаторов сортов.

Основная часть

В ходе отработки полученных результатов, сформированных на основе детального изучения районированного сортимента пшеницы и тритикале, ставилась задача адаптации к конкретным требованиям системы сортовой идентификации. Прежде всего, основной упор делался на отработку алгоритма и критериев выделения идентификационных параметров белковых электрофоретических спектров. Анализу был подвергнут целый ряд оценочных качественных и количественных характеристик белковых спектров, имеющих интерпретацию по отношению к поставленным задачам в области сортового контроля.

В целом весь спектр глиадина сортов пшеницы и тритикале можно дифференцировать с позиций редко и часто встречающихся компонентов в разрезе белковых субфракций. К числу общих позиций спектра всего набора проанализированных сортов были отнесены компоненты с подвижностью 12, 13, 26, 30, 33, 41, 50, 56, 61, 90, встречающиеся у 70% проанализированных сортов. Данный набор белковых компонентов можно отнести к видоспецифичным маркерам, характерным для представителей Triticum и Triticosecale.

К числу уникальных, единичных белковых компонентов были отнесены позиции 43, 47, 42, 99, встречающиеся только у 3% проанализированных сортов.

В качестве критериев межсортовой дифференциации представленного набора сортов нами были приняты относительная подвижность компонентов спектра и степень интенсивности (количество белка в компоненте).

При сравнении белковых спектров по отдельным компонентам были установлены несколько особенностей: уникальные компоненты, встречающиеся только у определенного сорта (маркеры сорта); компоненты с одинаковой электрофоретической подвижностью, но разной степенью интенсивности; компоненты с одинаковой электрофоретической подвижностью и степенью интенсивности. В качестве сортоспецифичных маркеров для целей сортового контроля и сертификации семян интерес представляют первые две особенности белковых спектров.

Кроме этого, была установлена специфичность белкового спектра проанализированного набора сортов в разрезе их зон селекции, что выражалось в присутствии четких отличительных позиций, определяемых уникальным аллельным состоянием глиадинкодирущих локусов в каждом регионе. Наличие маркерных позиций оценивалось по характеру их относительной электрофоретической подвижности на основе анализа всей совокупности сортов определенной культуры, созданных одним учреждением-оригинатором (таблица).

Полученные электрофоретические спектры индивидуальных семян были разделены на группы, имеющие одинаковый компонентный состав, т. е. на биотипы. К одному и тому же биотипу отнесены белковые спектры с идентичным компонентным составом (как по подвижности, так и по степени интенсивности), а также спектры, незначительно отличающиеся по интенсивности отдельных компонентов.

Таблица. Градация электрофоретической подвижности сортовых маркеров (по совокупности сортов) в зависимости от зоны селекции сорта

Культура	Код оригинатора сортов*
2 (BY)	76 (PL)	238 (PL)	97 (PL)	6 (BY)	142 (PL)	261 (RU)	274 (FR)
Пшеница озимая	15, 25, 55, 75, 80, 84, 90, 93, 98, 99	10, 22, 32, 43, 54, 61	18, 23, 34, 50, 85	*	13, 21, 31, 46, 51, 66, 72, 79	12, 26, 47, 62, 87, 92, 95	19, 27, 40, 59, 75	28, 35, 45, 60
Тритикале озимая	19, 20, 37, 59, 76	15, 17, 30	20, 44, 60, 100	15, 21, 36, 54, 68, 82, 95	12, 23, 25, 34, 44, 57, 66, 70, 80, 85, 90	*	*	*
Пшеница яровая мягкая	12, 20, 24, 35, 45, 47, 54, 63, 85, 95	15, 22, 34, 42, 52, 71	17, 32, 46, 55, 60, 91	13, 26, 44, 57	*	10, 25, 48, 62, 74	*	*
Тритикале яровая	24, 35, 42, 64, 72	10, 12, 36, 40, 77, 85	30, 49, 58, 88	37, 45, 51, 68	*	*	*	*

Примечание: код оригинатора сорта, код страны указаны на основе сведений, приведенных в Государственном Реестре сортов и древесно-кустарниковых пород; * сорта не включены в Реестр

Основываясь на данных критериях идентификации белковых биотипов, установили четкие отличительные позиции при сравнении биотипов сорта. Данные отличия выражались как в разной степени интенсивности белковых полос спектра, так и включением нового, ранее не проявлявшегося сочетания позиций в спектре.

Именно биотипы составляют структурную основу популяции, представляют собой группы особей растений, имеющих, как правило, идентичные морфологические признаки, но отличающиеся между собой вполне определенными устойчивыми, генетически обусловленными биологическими свойствами. Отмечено, что характерной особенностью биотипов является специфичность компонентного состава белков, что в свою очередь может быть использовано как фактор идентификации. Кроме того, учитывая особенности идентификационных критериев в составе структурных единиц (сорт, биотип, линия, клон и т. п.) и требования, предъявляемые к ним, в работе оценивали градации проявления идентификационных критериев (рис. 1). Ставилась задача _ оценить проявление критериев идентификации (выявить элементы отличий) при межсортовом и внутрисортовом сравнении.

Рис. 1. Проявление маркерных позиций по сортам и биотипам озимой мягкой пшеницы

Как следует из полученных данных, сорта озимой мягкой пшеницы характеризуются четкими идентификационными критериями по белковому спектру. Число дифференцирующих позиций (компонентов спектра) колеблется от трех до шести единиц, что позволяет четко и однозначно идентифицировать любой сорт на основе сравнения с эталонным белковым спектром каталога.

Межбиотипная дифференциация характеризуется несколько меньшим числом позиций спектра, однако по целому ряду сортов (Фантазия, Завет, Кобра, Дон 93, Финезия, Оливин, Канвеер) число идентификационных межбиотипных критериев находится на уровне межсортовых.

В целом полученные результаты наглядно свидетельствую о том, что использование метода электрофоретического фракционирования запасных белков семян позволяет однозначно идентифицировать генотипы, гарантированно оценивать их сортовую чистоту.

Сходной характеристикой обладали проанализированные сорта яровой мягкой пшеницы (рис. 2), для которых отмечено значительное (от четырех до семи) число идентификационных позиций при межсортовом сравнении.

Рис. 2. Проявление маркерных позиций по сортам и биотипам яровой мягкой пшеницы

Межбиотипная дифференциация обуславливается наличием от двух до четырех позиций компонентов, что позволяет однозначно идентифицировать белковые биотипы на предмет сохранности генетической конституции сорта.

Анализ критериев идентификации сортов яровой твердой пшеницы выявил одинаковое число маркерных компонентов спектра при межбиотипном сравнении, что позволяет оценивать генетическую конституцию сортов и гарантированно идентифицировать белковые биотипы. Межсортовая дифференциация обусловлена четырьмя (Ириде) или пятью (Мередиано) маркерными позициями белкового спектра, что позволяет рассматривать их в качестве идентификационных, в том числе при оценке сортовой чистоты.

Результаты оценки характера проявления идентификационных позиций белкового спектра у сортов озимой и яровой тритикале показывают иной характер их проявления (рис. 3, рис. 4).

Рис. 3. Проявление маркерных позиций по сортам и биотипам озимой тритикале

Рис. 4. Проявление маркерных позиций по сортам и биотипам яровой тритикале

Прежде всего, было отмечено, что дифференцирующие позиции спектра при межсортовом и межбиотипном сравнениях находятся на довольно близких уровнях, а в ряде случаев уровень межбиотипных отличий превышает уровень сортовых. В данном случае следует учитывать генетико-селекционные особенности культуры, создающие основу для формирования довольно сложной внутренней популяционной структуры, состоящей из большого числа генетических форм (биотипов) и имеющих возможность к модификациям.

В целом следует отметить, что, несмотря на выявленную особенность в проявлении маркерных позиций спектра сортов озимой тритикале, последние характеризуются четкими идентификационными критериями, как между сортами, так и внутри сортовой популяции между биотипами.

Характер проявления идентификационных позиций белкового спектра сортов яровой тритикале имел сходную особенность с сортами озимой тритикале. Однако в данном случае число сходных идентификационных критериев сортов и биотипов было несколько ниже, а по ряду сортов (Садко, Карго, Дублет, Ванад) число маркеров по белковым биотипам значительно (на 3_4 единицы) превышало число сортовых.

При позерновом анализе набора сортов были выделены несколько категорий _ слабополиморфные, среднеполиморфные и высокополиморфные сорта. Степень полиморфности оценивалась в зависимости от числа идентифицируемых белковых биотипов: для слабополиморфных _ в пределах одного биотипа, среднеполиморфных _ два биотипа, высокополиморфные имели в своем составе более двух биотипов.

Как правило, первый биотип является основным и имеет превалирующее содержание в сорте на уровне 62_73%. У слабополиморфных сортов эта величина составляет 47_80%, среднеполиморфных _ 50_60%, у высокополиморфных _ в пределах 40_50%. Следует отметить, что в группе высокополиморфных сортов соотношение неосновных биотипов (от третьего до пятого) чаще всего находится в равных долях и составляет 10_15%.

По результатам проведенной оценки к группе слабополиморфных были отнесены сорта пшеницы Саната, Узлет, Каравай, Кубус, Богатка, Нутка, Прэм'ера, Спектр, Оливин, Муза, Ядвися, Бомбона, Ириде; сорт тритикале Рунь.

Группа среднеполиморфных составляла самую многочисленную часть сортимента районированных сортов пшеницы. Было отмечено, что 70% всех проанализированных сортов пшеницы входили именно в группу среднеполиморфных и имели в составе сортовой популяции два белковых биотипа с четкими идентификационными критериями.

К группе высокополиморфных были отнесены сорта пшеницы Капылянка, Легенда, Дарота, насчитывающие по три биотипа. Было установлено, что 80% всех испытанных сортов тритикале имели в своем составе по три белковых биотипа. Следует отметить, что основные биотипы данных сортов характеризуются четкими критериями идентификации и имеют как минимум по 3_4 маркерных идентификационных белковых компонента спектра. Также установлено, что ряд сортов озимой тритикале (Беллак, Вольтарио) характеризовался наличием в структуре сорта четырех белковых биотипов, четкие идентификационные признаки из которых проявляли три основных биотипа.

Кроме того, в результате оценки характера и критериев межбиотипной дифференциации проанализированных сортов нами был установлен ряд особенностей _ неоднозначность в проявлении дифференцирующих позиций при сравнении биотипов между собой и разная частота встречаемости "маркерных" компонентов спектра. Прежде всего, было отмечено, что наибольшее число дифференцирующих белковых компонентов определяется в группе среднеполиморфных сортов. Причем в данной группе сортов было идентифицировано как наибольшее число дифференцирующих биотипы компонентов (от 10 до 12 единиц), так и высокая частота встречаемости уникальных (маркерных) позиций в 10,8_26,0% определений.

В группе высокополиморфных сортов тритикале межбиотипная дифференциация обусловлена в основном разной степенью выраженности белковых компонентов спектра и только в 15% _ четкой идентификацией по относительной подвижности. В свою очередь такая особенность белкового спектра сортов тритикале сочетается с довольно высокой частотой встречаемости "маркерных" биотипных позиций компонентов в 8,6_10,5% определений.

В целом проведенные оценки районированного сортимента пшеницы и тритикале позволили выявить четкие отличительные особенности, проявляемые по белковым признакам, на основе идентификации критериев электрофоретического спектра запасных белков семян, что может быть использовано как фактор идентификации сортов и биотипов.

Кроме того, проведенный анализ районированных сортов в очередной раз подтвердил высокую информативность и приемлемость к поставленным задачам метода электрофоретического анализа белков и позволил сформировать первый в Республике Беларусь полноценный каталог эталонных спектров и сортовых белковых формул для нужд профильных лабораторий по сертификации семенного материала.

Заключение

1. Установлена высокая разрешающая способность метода электрофоретического анализа запасных белков, что выражается в значительном числе идентификационных критериев, получаемых на основе метода. 2. Для проанализированного сортимента пшеницы и тритикале установлены общие, сортоспецифичные и уникальные позиции белкового спектра. 3. Определена специфичность аллельного состояния глиадинкодирующих локусов по сортам различных регионов создания. 4. Установлено различное количество маркерных компонентов белкового спектра при межсортовом и межбиотипном сравнении. 5. Установлена разная степень полиморфности для набора сортов: наименее полиморфными являются сорта пшеницы, наиболее полиморфными _ сорта тритикале. 6. Подтверждена приемлемость метода электрофореза запасных белков семян для целей сортовой идентификации и сертификации семенного материала.

Пшеница тритикале сорт селекция

Литература

1. Березкин, А. Н. Законодательная база семеноводства на современном этапе / А. Н. Березкин, А. М Малько, Л. А. Смирнова // Вестник семеноводства. - 2002. - №2. - С. 5-8. 2. Семена зерновых культур. Сортовые и посевные качества. Технические условия: СТБ 1073-97/ ИУ ТНПА №12-2010. введ. 01.07.2011. - Минск, 2011. - 20 с. 3. Ретер, К. Международный союз по охране селекционных достижений UPOV. Организация семеноводства - основа получения высоких урожаев и высококачественной продукции сельскохозяйственных культур / К. Рейтер. - Пятигорск, 2002. - С. 9-15. 4. Конарев, В. Г. Молекулярно-биологические исследования генофонда культурных растений в ВИРе (1967-2007 гг.) / В. Г. Конарев. - Изд. 2-е доп.; (сост.: В. В. Сидорова, А. В. Конарев). - СПб.: ВИР, 2007. - 134 с. 5. Конарев, В. Г. Белки пшеницы / В. Г. Конарев. - М.: Колос, 1980. - 350 с. 6. Рекомендации по использованию белковых маркеров в сортоиспытании, семеноводстве и семенном контроле / под ред. В. Г. Конарева. - М.-Л.: ВИР, 1998. - 20 с. 7. Идентификация и паспортизация сортов сельскохозяйственных культур (мягкой пшеницы, картофеля, томата, льна и свеклы) на основе ДНК-маркеров: метод. рекомендации / сост. В. С. Малышев, О. Ю. Урбанович, Н. А. Картель. - НАН Республики Беларусь. - Минск, 2006. - 27 с. 8. Федулова, Т. П. Информационные технологии в селекции / Т. П. Федулова // Сахарная свекла. - 2005. - № 8. - С. 17-18. 9. Поморцев, А. А. Идентификация и оценка сортовой чистоты семян ячменя методом электрофоретического анализа запасных белков зерна (теория вопроса, методика электрофореза, каталог электрофореграмм современных сортов ячменя, допущенных к использованию в Российской Федерации) / А. А. Поморцев, Е. В. Лялина. - М., 2003. - С. 85. 10. Поморцев, А. А. Полиморфизм культурного ячменя (Hordeum vulgare L.) Южной Аравии по гордеин-кодирующим локусам / А. А. Поморцев, Е. В. Лялина // Генетика. - 2007. - Т. 43. - № 5. - С. 660-667. 11. Поморцев, А. А. Полиморфизм культурного ячменя (Hordeum vulgare L.) Турции по гордеин-кодирующим локусам / А. А. Поморцев, С. П. Мартынов, Е. В. Лялина // Генетика, 2007. - Т. 43. - № 11. - С. 1542-1549. 12. Sozinov, A. A. and Poperelya, F. A. Genetic classification of prolamines and its use for plant breeding. Ann. Technol. Agric. - 1980.29: 229-245. 13. Metakovsky, E. V. Gliadin allele identification in common wheat. II. Catalogue of gliadin alleles in common wheat / J. Genet. and Breed. 1991. - 45: 325-344. 14. Государственный реестр сортов и древесно-кустарниковых пород / отв. ред. Бейня В. А., утв. ГУ "Государственная инспекция по испытанию и охране новых сортов растений. - Минск, 2011. - С. 15-18. 15. Дуктова, Н. А. Семена пшеницы и тритикале. Определение сортовой принадлежности, сортовой чистоты, генетической конституции и идентификация сортов методом электрофоретического анализа запасных белков семян: методика определения / Н. А. Дуктова, С. В. Егоров, Е. В. Егорова. - Горки: БГСХА, 2011. - 27 с.

Оценка районированных сортов зерновых культур для целей сертификации семенного материала

Похожие статьи