Влияние рН на активность ферментов. - Влияние значений рН и температуры на активность ферментов

Влияние концентрации водородных ионов на каталитическую активность

Ферментов состоит в воздействии ее на активный центр. При разных значениях рН в реакционной среде активный центр может быть слабее или сильнее ионизирован, больше или меньше экранирован соседними с ним фрагментами полипептидной цепи белковой части фермента и т. п. Кроме того, рН среды влияет на степень ионизации субстрата, фермент-субстратного комплекса и продуктов реакции, оказывает большое влияние на состояние фермента, определяя соотношение в нем катионных и анионных центров, что сказывается на третичной структуре белковой молекулы. Последнее обстоятельство заслуживает особого внимания, так как определенная третичная структура белка-фермента необходима для образования фермент-субстратного комплекса.

Ферменты, вообще говоря, активны только в определенном интервале рН, и в большинстве случаев для действия каждого фермента имеется определенный оптимум рН.

Наличие такого оптимума может иметь несколько причин:

    1. истинное обратимое влияние рН на скорость реакции V(в условиях, когда фермент насыщен субстратом) 2. влияние рН на сродство фермента к субстрату (в этом случае падение активности по обе стороны оптимума рН будет следствием понижения насыщения фермента субстратом в силу понижения сродства) 3. влияние рН на стабильность фермента, который может необратимо инактивироваться при рН по одну или по обе стороны от оптимума.

Перечисленные факторы могут действовать и в комбинации друг с другом, например, падение активности по одну сторону от оптимума рН может быть результатом уменьшения сродства фермента к субстрату, а по другую - результатом инактивации фермента. Поскольку в клетке содержатся сотни ферментов и для каждого из них существуют свои пределы опт рН, то изменение рН это один из важных факторов регуляции ферментативной активности. Так, в результате одной химической реакции при участии определенного фермента рН, оптимум которого лежит в пределах 7.0 - 7.2, образуется продукт, который является кислотой. При этом значение рН смещается в область 5,5 - 6.0. Активность фермента резко снижается, скорость образования продукта замедляется, но при этом активизируется другой фермент, для которого эти значения рН оптимальны и продукт первой реакции подвергается дальнейшему химическому превращению. (Еще пример про пепсин и трипсин).

Действие рассматриваемых факторов можно легко различить экспериментальным путем. Наличие необратимой инактивации устанавливают, сначала инкубируя фермент в растворах с различными значениями рН, а затем определяя его активность по возвращении рН к определенному значению.

На рис.1 приведены результаты опытов такого рода для моноаминоксидазы, из которых видно, что падение активности в щелочной области (по отношению к оптимуму рН) вызвано инактивацией фермента. Так как степень инактивации фермента со временем увеличивается, то и форма кривой, и положение кажущегося оптимума рН зависят от времени, в течение которого проводятся наблюдения; если бы можно было определить истинные начальные скорости сразу же после приведения раствора фермента к определенному значению рН, то тогда фактор инактивации был бы полностью исключен. Наблюдаемый оптимум рН аналогичен ложному " температурному оптимуму", который мы рассмотрим ниже.

влияние рн на активность моноаминоксидазы (флавинсодержащей)

Рис.1. Влияние рН на активность моноаминоксидазы (флавинсодержащей)

І-активность при рН, указанных на оси абсцисс,

ІІ-активность при рН=7,3 после инкубации в течение 5 мин при рН, указанных на оси абсцисс

Влияние рН на сродство фермента к субстрату можно исключить, если работать с такими концентрациями субстрата, которые достаточно высоки, чтобы насытить фермент при всех изучаемых значениях рН. Так как величина Км может значительно изменять при сдвиге рН, то мы отнюдь не вправе считать, что концентрация субстрата, достаточная для насыщения при одном из значений рН, будет достаточной для его насыщения и при других значениях рН. Чтобы определить влияние изменений собственно рН на активность фермента, необходимо получить достаточное количество данных по зависимости скорости реакции от концентрации субстрата при каждом значении рН, а затем с помощью одного из графических методов, показанных на рис.2 найти значения Км и V. Большинство приводимых в литературе кривых, характеризующих влияние рН на активность фермента, представляет собой сложные кривые, форма которых зависит частично от изменений V, а частично от изменений Км. Кривые, иллюстрирующие влияние изменения рН на Км и V приведены ниже.

шесть способов графического определения величин км и v по влиянию концентрации субстрата на скорость реакции

Рис.2. Шесть способов графического определения величин Км и V по влиянию концентрации субстрата на скорость реакции.

А-изменение величин, обратным рН-функциям, для системы с двумя ионизирующимися группами, рК которых равны 5 и 10

Б - изменение величин, обратным рН-функциям, для симметричной системы с рК 7 и 8.

изменения рн функций про изменении рн

Рис.3.Характер изменения рН функций про изменении рН:

Влияние рН на активность ферментов, подобно всем другим видам влияния рН, осуществляется путем изменения в состоянии ионизации отдельных компонентов системы при изменении рН. Такие изменения могут происходить в свободном ферменте, в фермент-субстратном комплексе или субстрате. Поскольку ферменты представляют собой белки, молекулы которых содержат большое число ионизирующихся групп, то они могут находится в виде целого ряда различных ионных форм, причем распределение всего количества фермента между этими ионными формами зависит от рН и от констант ионизации различных групп. Поскольку, однако, каталитическая активность наблюдается обычно в относительно небольшом интервале значений рН, можно думать, что только одна из ионных форм фермента (или, точнее, его активного центра) каталитически активна, как это и предполагали Михаелис и Девидсон еще в 1911г. Имеется ряд соображений в пользу того, что ионизация тех групп в ферменте, которые удалены от активного центра, либо оказывает незначительное влияние, либо совсем не оказывает влияния на каталитическую активность; в то же время состояние ионизации групп, расположенных в самом центре или около него, очень существенно.

Если фермент активен только в одном состоянии ионизации, то и этого следует, что активность его будет в значительной мере определятся его ионизацией двух особых групп в активном центре или вблизи него, а именно тех групп, которые в первую очередь ионизируются(или, наоборот, деионизируются) при сдвиге рН в кислую или щелочную сторону от оптимума. Эти группы иногда называют кислой и основной группами фермента. Мы не будем рассматривать другие процессы ионизации, которые могут протекать при сдвиге рН до значений, еще более удаленных от оптимума, так как эти процессы влияют на состояние уже неактивных форм фермента. Правда, молекула фермента может содержать несколько одинаковых групп, которые будут ионизироваться одновременно, но присутствие в активном центре более одной такой группы маловероятно. В силу рассмотренных выше обстоятельств влияние рН на скорость ферментативных реакций обсуждают часто с учетом только двух ионизирующихся групп, используя при этом уравнения, применимые к двухосновным кислотам или к простым амфолитам, хотя без сомнения, такой подход является слишком упрощенным.

Похожие статьи




Влияние рН на активность ферментов. - Влияние значений рН и температуры на активность ферментов

Предыдущая | Следующая