Определение активности протеиназ по реакции с реактивом Фолина. - Влияние значений рН и температуры на активность ферментов

К 0.5 мл того же ТХУ-центрифуганта добавляют 0.5 мл 2.5 мМ раствора CuSO4 , 4 мл 0.5 н. раствора NaOH и 1.5 мл разбавленного в три раза реактива Фолина. Через 30 минут измеряют на спектрофотометре оптическую плотность при 760 нм

Калибровочные кривые по пепсиновому гидролизату окисленного лизоцима. 30 мг окисленного лизоцима растворяют в 50 мл подкисленной воды (40 мл Н2О + 10 мл 0.3 н. раствора HСl. и к полученном раствору добавляют 0.5 мг пепсина. Смесь оставляют при комнатной температуре на сутки. По истечении этого срока инкубации препарат не дает осадка с ТХУ. Этот препарат используют наряду с растворами аргинина и тирозина в качестве стандарта для построения калибровочных кривых. Приготовляют разведения с содержанием от 60 до 600 мкг/мл исходного лизоцима. В пробы вводят соответствующее опытным пробам количество ТХУ. Приготовляют также растворы свободного аргинина и тирозина с концентрациями от 0.04 до 0.25 мкмоль/мл. Из каждой пробы берут по 0.5 мл (в трех параллельных пробах) для определения содержания аргинина и тирозина по Фолину.

Калибровочные кривые. Количество аминокислоты или ее остатка в гидролизате в наномолях на 1 мл.

Кривая 3 получена с помощью микрометода на основе реакции Сакагучи (520 нм) по растворам аргинина (х) и по пептидному гидролизу лизоцима (о); 1 и 2 - с помощью реакции Фолина (760 нм): 2 - по растворам тирозина, 1 - по пептидному гидролизу лизоцима. Значение оптической плотности проб, измеренные при 520 нм или 760 нм, нанесены на график против концентрации аргинина или тирозина или их остатков в пепсиновом гидролизате лизоцима. Кривая 1, проходящая выше кривой 2, получена при реакции реактива Фолина с растворами тирозина эквивалентной концентрации. Кривая 3 получена в результате реакции Сакагучи как со свободным аргинином, так и с его остатками, содержащимися в пептидах пепсинового гидролизата лизоцима. Расположение опытных точек точно по прямой свидетельствует о том, что в гидролизате, осажденном ТХУ, весь аргинин полностью реагирует с реактивом Сакагучи.

Воздействие Фолина на тирозин не специфично. Кроме тирозина в пептидах с этим реактивом реагируют триптофан, цистеин. Образуемые медью с тетрапептидами и полипептидами биуретовые комплексы облегчают такое взаимодействие. Следовательно, выражение величины активности протеолитических ферментов в тирозиновых эквивалентах и по Фолину, как это иногда делают, неправильно.

Похожие статьи




Определение активности протеиназ по реакции с реактивом Фолина. - Влияние значений рН и температуры на активность ферментов

Предыдущая | Следующая