Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную кальциевую активность культивируемых клеток гиппокампа при моделировании гипоксии - Антигипоксическое и нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии in vivo и in vintro
На 21-й день in vitro в клетках гиппокампа наблюдалась синхронизованная спонтанная кальциевая активность. Частота возникновения кальциевых осцилляций в нейронной сети составляла 6,83±1,78 осцилляций в 1 мин. Активность проявляло 83,9±5,57% клеток. При замене нормоксической культуральной среды на гипоксическую (0,37 мл/л О2) происходило снижение спонтанной кальциевой активности клеток гиппокампа вплоть до практически полного ее исчезновения к 3-й минуте наблюдения. Активность сохраняли всего 5,01±1,84 % клеток, частота осцилляций составила 0,14±0,03 осцилляции в минуту. После реоксигенации активность возобновлялась, однако процент активных клеток был существенно ниже, чем до гипоксического воздействия (22,1±7,2%) (рис.13).
Рисунок 13 Растровая диаграмма Са2+ осцилляций в культуре клеток гиппокампа при моделировании гипоксии: А - контроль (10 мин гипоксия/реоксигенация без аппликации каннабиноида) Б - N-ADA 10 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 10 мкМ)
Антигипоксический эффект N-ADA проявлялся в частичном сохранении спонтанной кальциевой активности во время гипоксии и нормализации кальциевой активности в постгипоксическом периоде. Во время гипоксического воздествия активность сохраняло 24,5±6,91% клеток, изначально проявляющих активность.
Частота кальциевых осцилляций во время гипоксического воздействия снизилась в пять раз (с 6,83±1,78 до 1,3±0,23 осцилляций в минуту). В период реоксигенации уровень кальциевой активности в группе культур, получавших аппликацию N-ADA 10 мкМоль во время гипоксии не отличался от контрольной группы.
Оценка гипоксического воздействия на кальциевую активность в отдаленном постгипоксическом периоде проводилась на 7 сутки после гипоксии. Доля клеток в поле зрения, в которых регистрировались спонтанные кальциевые осцилляции, через 7 суток после острой гипобарической гипоксии снижалось с 69,3±5,57 % до 19,06±7,0%. клеток (рис. 14).
Рисунок 14 Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную кальциевую активность клеток гиппокампа через 7 суток после острой нормобарической гипоксии. * - статистически достоверные (p<0,05) отличия от контрольной группы культур, не подвергавшихся гипоксии, критерий Манна-Уитни # - статистически достоверное (p<0,05) отличие от группы культур, подвергавшихся гипоксии и не получавших аппликацию эндоканнабиноида, критерий Манна-Уитни
Применение N-ADA 10 мкМ во время гипоксии и в первые сутки после него предотвращало потерю функциональной кальциевой активности клетками культур гиппокампа. В группе опытных культур, получавших аппликацию N-ADA, доля клеток, проявляющих кальциевую активность составила 56,37±8,69%, что достоверно больше, чем в контрольной группе культур, подвергшихся гипоксическому воздействию. Можно предположить, что существенное снижение уровня спонтанной кальциевой активности связано с гибелью части нейронов в постгипоксическом периоде (см. раздел 3.1.3.), редукцией синаптических контактов и разрушением нейронных сетей. У 60% культур длительность и частота генерации кальциевых осцилляций клетками, сохранившими активность, после гипоксии существенно не изменялась, еще у 40% происходила существенная модификация формы кальциевых осцилляций. 10-минутная гипоксия в таких культурах вызывала достоверное увеличение длительности и уменьшение частоты кальциевых осцилляций в отдаленном постгипоксическом периоде, по сравнению с культурами, не подвергавшимися гипоксическому воздействию (рис. 15-16). Следует отметить, что увеличение длительности осцилляций после гипоксического воздействия происходит за счет появления в профиле активности клеток "суперосцилляций", длительность которых составляет до 100 с (рис. 17).
В группе культур, подвергавшихся гипоксическому воздействию, длительность суперосцилляций составила 89,19±8,04 секунды. Обнаруженные нами изменения спонтанной кальциевой активности подтверждают гипотезу о том, что изменение активности нейронной сети после гипоксического воздействия связано с действием высоких концентраций возбуждающего нейромедиатора глутамата.
Рисунок 15 Длительность кальциевых суперосцилляций в культуре клеток гиппокампа на 7 день после гипоксии. # - статистически достоверное (p<0,05) отличие от группы культур, подвергавшихся гипоксии в отсутствие N-ADA, парный критерий Стьюдента
Повышенная стимуляция глутаматных рецепторов приводит к накоплению в нейронах Са2+ в результате его усиленного поступления через ионные каналы и, соответственно, к стойкому повышению [Ca2+]i, что проявляется в развитии суперосцилляций. Соответственно увеличению длительностей осцилляций, также отмечается уменьшение их частоты.
Такие суперосцилляции могут быть разными по продолжительности, их характеризует временное повышение базовой [Ca2+]i, на фоне которого происходит несколько спонтанных осцилляций. Подобные суперосцилляции наблюдаются в ходе дифференцировки культур, однако их длительность не превышает 45-50 секунд (Митрошина с соавт., 2011, Широкова с соавт., 2013).
Рисунок 16 Параметры спонтанной кальциевой активности клеток гиппокампа на 7 день после гипоксии: А - длительность кальциевых суперосцилляций Б - частота возникновения Са2+ осцилляций в культурах клеток гиппокампа. * - статистически достоверные (p<0,05) отличия от контрольной группы культур, не подвергавшихся гипоксии, парный критерий Стьюдента, # - статистически достоверное (p<0,05) отличие от группы культур, подвергавшихся гипоксии и не получавших аппликацию эндоканнабиноида, парный критерий Стьюдента
Аппликация N-ADA при гипоксии и в первые сутки после нее оказывает дозозависимый нейропротекторный эффект на кальциевую активность нейронных сетей. N-ADA в концентрации 2,5 мкМ не влияет на длительность суперосцилляций, а в концентрациях 6 и 10 мкМ достоверно уменьшает ее (41,37±2,03 с и 48,66±5,74 с, соответственно).
Рисунок 17 Характерные профили кальциевой активности нейронов на 7 день после моделирования гипоксии в культурах клеток гиппокампа. По оси абсцисс - время, с, по оси ординат - интенсивность флуоресценции, усл ед.: 1 - интактные; 2 - контроль (10 мин гипоксия/реоксигенация без аппликации каннабиноида); 3 - N-ADA 2,5 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 2,5 мкМ; 4 - N-ADA 6 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 6 мкМ/л); 5 - N-ADA 10 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 10 мкМ/л)
О нормализации профиля кальциевой активности можно судить по приведенным ниже характерным растровым диаграммам (рис. 18), на котором штрихами отмечены моменты возникновения кальциевых осцилляций в клетках.
Рисунок 18 Растровая диаграмма Са2+ осцилляций в культуре клеток гиппокампа: А - до гипоксии, 21 DIV; Б - через 2 часа после гипоксии, 21 DIV; В - через 7 суток после гипоксии, 28 DIV с аппликацией 6 мкМ N-АДА; Г - через 7 суток после гипоксии, 28 DIV с аппликацией 10 мкМ N-АДА. По оси ординат указан номер рассматриваемой клетки, по оси абсцисс - время. Моменты возникновения кальциевых осцилляций отмечены штрихами
Таким образом, применение N-ADA в концентрациях 6 мкМ и 10 мкМ позволяет нормализовать кальциевую активность культивируемых клеток гиппокампа в отдаленном постгипоксическом периоде. Можно предположить, что в основе этого эффекта лежит реализация механизма DSE, описанного в обзоре литературы. Активация пресинаптических CBR тормозит пресинаптические кальциевые токи через потенциал-зависимые Са2+-каналы N - и P/Q-типов и в результате подавляется экзоцитоз глутамата, снижается вход кальция через постсинаптические NMDA рецепторы, что приводит к нормализации концентрации кальция в постсинаптическом окончании, зарегистрированной в наших экспериментах (Twitchell et al., 1997; Kano et al., 2009).
Похожие статьи
-
Объект исследования Объектом исследований In vitro Служили первичные диссоциированные культуры клеток гиппокампа, полученные от 18-дневных мышиных...
-
Оценка жизнеспособности клеток, культивируемых в 48-луночных планшетах, проводилась в период нормоксии (21 DIV) и через 1, 3, 7 и 10 суток после...
-
Для имиджинговых исследований функциональной активности по параметру изменений [Ca2+]i, отражающих функциональное состояние кальциевого гомеостаза...
-
Нейронная сеть мозга является структурно-функциональной единицей, отвечающей за процессы обработки, хранения и воспроизведения информации. Одним из...
-
Спонтанная биоэлектрическая активность Мультиэлектродные матрицы MED64 и MEA60 Мультиэлектродная система MED64, основанная на технологии плоских...
-
Для моделирования острой гипобарической гипоксии (ОГБГ) In vivo Использовалась вакуумная проточная барокамера при внешней температуре 20-22оС. Мыши...
-
Гипоксию In vitro Моделировали на 21-й DIV путем замены на 10 минут нормоксической культуральной среды на среду без кислорода. Для вытеснения кислорода...
-
Гипоксия - широко распространенное состояние организма, возникающее как из-за дефицита кислорода во внешней среде, так и при самых различных патологиях,...
-
Для оценки способностей животных к формированию и сохранению пространственной долговременной памяти применялось тестирование в водном лабиринте Морриса....
-
Взаимодействие агонистов с CBR-1 и CBR-2 приводит к диссоциации сопряженных с ними Gi-белков на б субъединицу и вг димер, которые участвуют в регуляции...
-
Спонтанную биоэлектрическую активность нейронов регистрировали с использованием мультиэлектродной системы MED64 и MEA60 при стандартных условиях...
-
Доказательства существования CBR в мозге были получены в середине 80-х годов (Howlett, Fleming, 1984). На сегодняшний день наиболее полно изучено...
-
Острые и хронические повреждения нервной системы, в том числе, травмы, ишемические или воспалительные заболевания, остаются серьезной проблемой...
-
ст "открытое поле" Установка для теста "открытое поле" представляет собой круглую камеру диаметром 90 см с пластиковыми стенками высотой 28 см. Пол...
-
CBR-1 представлены на пресинаптических окончаниях ГАМК - эргических, глутаматэргических, холинэргических и норадреналинэргических нейронов, их активация...
-
Каннабиноиды синтезируются и реализуются локально On demand (по требованию). Таким образом, уровень их генерации не является постоянным, а кинетика их...
-
N-арахидоноилдофамин Все агонисты CBR принято подразделять на растительные (фитоканнабиноиды), эндогенные и синтетические. Среди фитоканнабиноидов (рис....
-
Поскольку не все эффекты, вызываемые каннабиноидами, можно объяснить активацией CBR-1 и CBR-2, предполагается также наличие других, еще не до конца...
-
Влияние церулоплазмина на количественный состав и фагоцитарную функцию лейкоцитов при асептическом воспалении Воспалительные процессы различной этиологии...
-
Влияние церулоплазмина на количественный состав лейкоцитов при "невоспалительных" лейкоцитозах На предыдущем этапе работы было показано, что Цп способен...
-
Первой группе интактных животных Цп вводили внутрибрюшинно однократно в дозе 30 мг/кг. 30 мг/кг - доза, составляющая 75% от физиологической концентрации...
-
На следующем этапе исследования у нас возник вопрос о возможности влияния Цп на изменение функциональной активности лейкоцитов при воспалении на...
-
При лейкоцитозе в ответ на введение пирогенала нами отмечено изменение функциональной активности лейкоцитов. В контрольной группе, по данным ХЛ -...
-
Диагностика - Лечебные и профилактические мероприятия при гипоксии внутриутробного плода
При диагностике гипоксии необходима комплексная оценка результатов различных методов исследований. Основными методами исследования гипоксии плода...
-
Реализация функциональной активности фагоцитирующих клеток находится, в том числе, под контролем различных отделов нервной системы и регуляторных...
-
Для изучения влияния Цп на процессы генерации АФК фагоцитами в условиях in vitro использовали цельную кровь здоровых людей - доноров крови, так как...
-
Многочисленными исследованиями показано, что чувствительность к патогенам и характер течения различных инфекционных процессов у насекомых зависит от...
-
РОФ - функционально разнородная группа белков, способных быстро изменять свою концентрацию при различных нарушениях гомеостаза независимо от природы и...
-
Одним из представителей РОФ третьего эшелона является Цп - исключительно активный гликопротеин 2 - глобулиновой фракции сыворотки крови человека и высших...
-
Классификация - Лечебные и профилактические мероприятия при гипоксии внутриутробного плода
Гипоксия классифицируется по типу, длительности и течению: 1. По типу: 1.1. Гипоксическая гипоксия, встречается при снижении насыщения кислородом...
-
Экспериментальные данные за последнее время, как отечественных, так и зарубежных исследователей свидетельствуют о высокой биологической активности...
-
Введение - Исследование воздействия электромагнитного поля низкой частоты на клетки крови
Электромагнитное поле (ЭМП) окружает нас с самого рождения. Электромагнитная среда нашей планеты определяется в основном электрическим и магнитным полями...
-
Индукция интерфероном устойчивости клеток к вирусам - Строгие постулаты Коха
Клетки в культуре in vitro, в которых синтез интерферона индуцирован убитым вирусом или полинуклеотидами, также становятся устойчивыми к вирусам. Кроме...
-
Адгезивную способность лейкоцитов изучали по их способности прилипать к эндотелию сосудистой стенки по разработанной оригинальной методике. У крысы под...
-
- трофобласт и эмбриобласт - первичная полоска и Гензеновский узелок + эпибласт и гипобласт - эктодерма и энтодерма - синцитиотрофобласт и цитотрофобласт...
-
Этиология и патогенез - Лечебные и профилактические мероприятия при гипоксии внутриутробного плода
Причинами острой гипоксии являются: 1. Неадекватная перфузия крови к плоду из материнской части плаценты (например при нарушении дыхания роженицы) . 2....
-
Диагностика, Инструментальное обследование пациентов при ИМ - Острый инфаркт миокарда
Лабораторные методы диагностики инфаркта миокарда: Џ Анализ крови Џ Биохимический анализ крови Џ Кровь на миоглобин Резорбционно-некротический синдром -...
-
Преходящая форма фибрилляции предсердий с указанием циркадной активности: 4.1.1 в дневные часы (чч. мм.) 4.1.2 в ночные часы (чч. мм.) 4.1.3 без...
-
На первом этапе эксперимента к цельной крови добавляли растворы Цп различных концентраций (мкг/мл): 100,0; 200,0; 300,0; 400,0; 600,0; что...
-
Осмотр грудной клетки Дыхание через нос не затруднено. Тип дыхания - грудной. Дыхание ритмичное, ЧДД - 18 в минуту. Форма грудной клетки правильная,...
Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную кальциевую активность культивируемых клеток гиппокампа при моделировании гипоксии - Антигипоксическое и нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии in vivo и in vintro