Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную кальциевую активность культивируемых клеток гиппокампа при моделировании гипоксии - Антигипоксическое и нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии in vivo и in vintro

На 21-й день in vitro в клетках гиппокампа наблюдалась синхронизованная спонтанная кальциевая активность. Частота возникновения кальциевых осцилляций в нейронной сети составляла 6,83±1,78 осцилляций в 1 мин. Активность проявляло 83,9±5,57% клеток. При замене нормоксической культуральной среды на гипоксическую (0,37 мл/л О2) происходило снижение спонтанной кальциевой активности клеток гиппокампа вплоть до практически полного ее исчезновения к 3-й минуте наблюдения. Активность сохраняли всего 5,01±1,84 % клеток, частота осцилляций составила 0,14±0,03 осцилляции в минуту. После реоксигенации активность возобновлялась, однако процент активных клеток был существенно ниже, чем до гипоксического воздействия (22,1±7,2%) (рис.13).

растровая диаграмма са2+ осцилляций в культуре клеток гиппокампа при моделировании гипоксии

Рисунок 13 Растровая диаграмма Са2+ осцилляций в культуре клеток гиппокампа при моделировании гипоксии: А - контроль (10 мин гипоксия/реоксигенация без аппликации каннабиноида) Б - N-ADA 10 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 10 мкМ)

Антигипоксический эффект N-ADA проявлялся в частичном сохранении спонтанной кальциевой активности во время гипоксии и нормализации кальциевой активности в постгипоксическом периоде. Во время гипоксического воздествия активность сохраняло 24,5±6,91% клеток, изначально проявляющих активность.

Частота кальциевых осцилляций во время гипоксического воздействия снизилась в пять раз (с 6,83±1,78 до 1,3±0,23 осцилляций в минуту). В период реоксигенации уровень кальциевой активности в группе культур, получавших аппликацию N-ADA 10 мкМоль во время гипоксии не отличался от контрольной группы.

Оценка гипоксического воздействия на кальциевую активность в отдаленном постгипоксическом периоде проводилась на 7 сутки после гипоксии. Доля клеток в поле зрения, в которых регистрировались спонтанные кальциевые осцилляции, через 7 суток после острой гипобарической гипоксии снижалось с 69,3±5,57 % до 19,06±7,0%. клеток (рис. 14).

влияние n-арахидоноилдофамина на спонтанную кальциевую активность клеток гиппокампа через 7 суток после острой нормобарической гипоксии

Рисунок 14 Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную кальциевую активность клеток гиппокампа через 7 суток после острой нормобарической гипоксии. * - статистически достоверные (p<0,05) отличия от контрольной группы культур, не подвергавшихся гипоксии, критерий Манна-Уитни # - статистически достоверное (p<0,05) отличие от группы культур, подвергавшихся гипоксии и не получавших аппликацию эндоканнабиноида, критерий Манна-Уитни

Применение N-ADA 10 мкМ во время гипоксии и в первые сутки после него предотвращало потерю функциональной кальциевой активности клетками культур гиппокампа. В группе опытных культур, получавших аппликацию N-ADA, доля клеток, проявляющих кальциевую активность составила 56,37±8,69%, что достоверно больше, чем в контрольной группе культур, подвергшихся гипоксическому воздействию. Можно предположить, что существенное снижение уровня спонтанной кальциевой активности связано с гибелью части нейронов в постгипоксическом периоде (см. раздел 3.1.3.), редукцией синаптических контактов и разрушением нейронных сетей. У 60% культур длительность и частота генерации кальциевых осцилляций клетками, сохранившими активность, после гипоксии существенно не изменялась, еще у 40% происходила существенная модификация формы кальциевых осцилляций. 10-минутная гипоксия в таких культурах вызывала достоверное увеличение длительности и уменьшение частоты кальциевых осцилляций в отдаленном постгипоксическом периоде, по сравнению с культурами, не подвергавшимися гипоксическому воздействию (рис. 15-16). Следует отметить, что увеличение длительности осцилляций после гипоксического воздействия происходит за счет появления в профиле активности клеток "суперосцилляций", длительность которых составляет до 100 с (рис. 17).

В группе культур, подвергавшихся гипоксическому воздействию, длительность суперосцилляций составила 89,19±8,04 секунды. Обнаруженные нами изменения спонтанной кальциевой активности подтверждают гипотезу о том, что изменение активности нейронной сети после гипоксического воздействия связано с действием высоких концентраций возбуждающего нейромедиатора глутамата.

длительность кальциевых суперосцилляций в культуре клеток гиппокампа на 7 день после гипоксии

Рисунок 15 Длительность кальциевых суперосцилляций в культуре клеток гиппокампа на 7 день после гипоксии. # - статистически достоверное (p<0,05) отличие от группы культур, подвергавшихся гипоксии в отсутствие N-ADA, парный критерий Стьюдента

Повышенная стимуляция глутаматных рецепторов приводит к накоплению в нейронах Са2+ в результате его усиленного поступления через ионные каналы и, соответственно, к стойкому повышению [Ca2+]i, что проявляется в развитии суперосцилляций. Соответственно увеличению длительностей осцилляций, также отмечается уменьшение их частоты.

Такие суперосцилляции могут быть разными по продолжительности, их характеризует временное повышение базовой [Ca2+]i, на фоне которого происходит несколько спонтанных осцилляций. Подобные суперосцилляции наблюдаются в ходе дифференцировки культур, однако их длительность не превышает 45-50 секунд (Митрошина с соавт., 2011, Широкова с соавт., 2013).

параметры спонтанной кальциевой активности клеток гиппокампа на 7 день после гипоксии

Рисунок 16 Параметры спонтанной кальциевой активности клеток гиппокампа на 7 день после гипоксии: А - длительность кальциевых суперосцилляций Б - частота возникновения Са2+ осцилляций в культурах клеток гиппокампа. * - статистически достоверные (p<0,05) отличия от контрольной группы культур, не подвергавшихся гипоксии, парный критерий Стьюдента, # - статистически достоверное (p<0,05) отличие от группы культур, подвергавшихся гипоксии и не получавших аппликацию эндоканнабиноида, парный критерий Стьюдента

Аппликация N-ADA при гипоксии и в первые сутки после нее оказывает дозозависимый нейропротекторный эффект на кальциевую активность нейронных сетей. N-ADA в концентрации 2,5 мкМ не влияет на длительность суперосцилляций, а в концентрациях 6 и 10 мкМ достоверно уменьшает ее (41,37±2,03 с и 48,66±5,74 с, соответственно).

характерные профили кальциевой активности нейронов на 7 день после моделирования гипоксии в культурах клеток гиппокампа. по оси абсцисс - время, с, по оси ординат - интенсивность флуоресценции, усл ед

Рисунок 17 Характерные профили кальциевой активности нейронов на 7 день после моделирования гипоксии в культурах клеток гиппокампа. По оси абсцисс - время, с, по оси ординат - интенсивность флуоресценции, усл ед.: 1 - интактные; 2 - контроль (10 мин гипоксия/реоксигенация без аппликации каннабиноида); 3 - N-ADA 2,5 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 2,5 мкМ; 4 - N-ADA 6 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 6 мкМ/л); 5 - N-ADA 10 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 10 мкМ/л)

О нормализации профиля кальциевой активности можно судить по приведенным ниже характерным растровым диаграммам (рис. 18), на котором штрихами отмечены моменты возникновения кальциевых осцилляций в клетках.

растровая диаграмма са2+ осцилляций в культуре клеток гиппокампа

Рисунок 18 Растровая диаграмма Са2+ осцилляций в культуре клеток гиппокампа: А - до гипоксии, 21 DIV; Б - через 2 часа после гипоксии, 21 DIV; В - через 7 суток после гипоксии, 28 DIV с аппликацией 6 мкМ N-АДА; Г - через 7 суток после гипоксии, 28 DIV с аппликацией 10 мкМ N-АДА. По оси ординат указан номер рассматриваемой клетки, по оси абсцисс - время. Моменты возникновения кальциевых осцилляций отмечены штрихами

Таким образом, применение N-ADA в концентрациях 6 мкМ и 10 мкМ позволяет нормализовать кальциевую активность культивируемых клеток гиппокампа в отдаленном постгипоксическом периоде. Можно предположить, что в основе этого эффекта лежит реализация механизма DSE, описанного в обзоре литературы. Активация пресинаптических CBR тормозит пресинаптические кальциевые токи через потенциал-зависимые Са2+-каналы N - и P/Q-типов и в результате подавляется экзоцитоз глутамата, снижается вход кальция через постсинаптические NMDA рецепторы, что приводит к нормализации концентрации кальция в постсинаптическом окончании, зарегистрированной в наших экспериментах (Twitchell et al., 1997; Kano et al., 2009).

Похожие статьи




Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную кальциевую активность культивируемых клеток гиппокампа при моделировании гипоксии - Антигипоксическое и нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии in vivo и in vintro

Предыдущая | Следующая