Иммуноэлектрофорез - Производство биоферментных препаратов

(ИЭФ) -- метод исследования антигенного состава биологических материалов, сочетающий электрофорез и иммунодиффузию. Впервые описан Грабаром и Уильямсом в 1953 году, в 1965 году метод был модифицирован.

Метод основан на способности заряженных частиц к перемещению в агаром геле или на пленках из ацетата целлюлозы в электрическом поле. В последующем проводят анализ полученных фракций методом двойной диффузии в агаре или на пленке. Антисыворотку вносят в траншею, расположенную параллельно направлению электрофоретического разделения белковых фракций. При встрече антигена с антителом образуются линии преципитации. По количеству этих линий судят о чистоте препарата. Метод рекомендован для препаратов иммуноглобулина.

Методика иммуноэлектрофореза в агаре

Методика определения. На стеклянную пластину размером 120x90 мм наливают 18-20 мл расплавленного агара концентрации 1,25%, чтобы получился слой толщиной 2-3 мм. После застывания агарового геля вырезают лунки, используя для этого специальный штамп (рис. 1 - не приводится).

Препараты вносят в лунки при помощи тонко оттянутого капилляра. В одну из лунок вносят нормальную сыворотку.

В электродные камеры наливают барбиталовый буферный раствор (pH 8,2). Пластинки с агаровым гелем помещают в аппарат для электрофореза. На оба конца пластинок помещают полоски хроматографической или фильтровальной бумаги размером 120x60 мм, сложенной в 5-6 слоев, которые соединяют с электродными камерами. Электрофорез проводят при силе тока 10 мА и напряжении 100 В в течение 1,0-1,5 ч.

После проведения электрофореза между лунками в агаровом геле вырезают траншеи и вносят в них антисыворотку, преципитирующую сывороточные белки. Пластинку помещают во влажную камеру, в которую ставят бюкс с водой и несколькими кристалликами фенола, через 24-48 ч пластинку вынимают из влажной камеры, погружают в кювету с 0,9%-м раствором натрия хлорида (консервант - несколько кристалликов фенола) и отмывают в течение 2-3 сут. от белка, не принявшего участие в образовании преципитата. Раствор меняют 3-4 раза в сутки.

Отмытые пластинки высушивают на воздухе. Для равномерного высушивания пластинки с агаровым гелем накрывают фильтровальной бумагой, бумагу над лунками и траншеями прокалывают иглой. Чтобы ускорить процесс высушивания, можно использовать вентилятор. После высушивания пластинки бумагу смачивают водой и удаляют.

Пластинки с высушенным агаровым гелем окрашивают в течение 2 ч в растворе красителя.

Оценивают локализацию и число линий преципитации препаратов иммуноглобулинов относительно линий преципитации сыворотки крови, которая должна проявлять не менее 15 линий преципитации с антисывороткой. Оценку качества каждой новой серии антисыворотки проводят со стандартным образцом тест-системы для определения антигенного состава препаратов из сыворотки крови человека методом иммуноэлектрофореза.

Примечания. 1. Приготовление 1,25%-го агарового геля. 12,5 г агара помещают в химический стакан, вместимостью 1 л, приливают 500 мл воды и оставляют для набухания геля в течение часа при температуре 18-20 град. C. Стакан с содержимым помещают в кипящую водяную баню и выдерживают до полного расплавления агара. Объем раствора геля доводят водой до 500 мл и затем добавляют равный объем барбиталового буферного раствора (pH 8,2) (концентрацию соли и кислоты, указанную в п. 2 следует увеличить в 2 раза). Раствор агара фильтруют через марлю (2-3 слоя), прибавляют мертиолят до концентрации 100 мкг/мл и разливают во флаконы по 40-50 мл (количество, необходимое на две пластинки). Расплавленный агар должен быть прозрачным.

Рекомендуется использовать отечественный агар высокоочищенный (ВФС 42-90 ВС-87), а также агар иностранных фирм (например, агар Дифко).

    2. Приготовление барбиталового буферного раствора (pH 8,2). 47,6 барбитал-натрия и 69 мл соляной кислоты концентрации 1 моль/л растворяют в 4,3 л воды. 3. Обработка стеклянных пластинок. На стеклянные пластинки (лучше использовать фотопластинки), обработанные хромовой смесью, наносят несколько капель расплавленного 1,25%-го агара и растирают тонким слоем (чтобы агаровый гель лучше прилипал к стеклу). Пластинку высушивают при температуре 75-80 град. C. 4. Приготовление пластинок с агаровым гелем. Стеклянные пластинки помещают на горизонтальную поверхность и наливают расплавленный при температуре 60-80 град. C 1,25%-й агар осторожно, без образования пузырьков воздуха.

В геле вырезают лунки для анализируемых проб, а после проведения электрофореза - траншеи для преципитирующей иммунной сыворотки (рис. 1 - не приводится).

Траншеи вырезают специальным резцом, лунки для антигена вырезают поперечно-срезанным концом пастеровской пипетки. Лунки и траншеи можно вырезать, положив пластинку на бумагу с нанесенным рисунком, или используют специальный штамп (коробочка со съемной металлической крышкой, на которой вырезаны траншеи и лунки).

    5. Состав красителя: амидочерный 10Б - 1,0 г, 450 мл раствора уксусной кислоты концентрации 0,1 моль/л, 550 мл раствора натрия ацетата концентрации 0,1 моль/л. 6. Приготовление 2%-го раствора уксусной кислоты. 20 мл ледяной уксусной кислоты вносят в мерный цилиндр, вместимостью 1 л, объем раствора доводят водой до метки.

Метод иммуноэлектрофореза на пленках из ацетата целлюлозы

Методика определения. На увлажненной буферным раствором пленке из ацетата целлюлозы формируют стартовые канавки и продольные траншеи, используя для этого специальное устройство (штамп). На пленку наносят препараты, проводят электрофорез, как указано в методике 23 ("Определение однородности сывороточных препаратов методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы"). После проведения электрофореза по линии траншей помещают узкие полоски (1x4,5 мм) фильтровальной бумаги, пропитанные антисывороткой. Пленку на рамке оставляют во влажной камере в течение 24 ч, после чего пленку 3-4 раза отмывают от избытка антисыворотки 0,9%-м раствором натрия хлорида. Пленку окрашивают красителем, промывают, высушивают, просветляют в вазелиновом масле и оценивают результаты, как указано в методике.

Для окрашивания линий преципитации, помимо красителя амидочерного 10Б, можно использовать 1%-й раствор фуксина кислого в растворе уксусной кислоты концентрации 2 моль/л. Время выдерживания пленки с красителем составляет 3-5 мин. Избыток красителя отмывают в растворе уксусной кислоты концентрации 1 моль/л.

Примечание. Приготовление красителя на основе фуксина кислого. К 1 г фуксина кислого прибавляют 10 мл ледяной уксусной кислоты, 3 г трихлоруксусной кислоты и 90 мл спирта. Смесь для насыщения оставляют на 24 ч, периодически встряхивают.

Похожие статьи




Иммуноэлектрофорез - Производство биоферментных препаратов

Предыдущая | Следующая