Механизм действия токсинов - Характеристика пестицидных белков Bacillus thuringiensis и их генетических детерминант

Клетками-мишенями для белков Cry-семейства (т. н. д-эндотоксинов) являются эпителиальные клетки средней кишки насекомых, а также некоторых других беспозвоночных. Белки Cyt-семейства, в отличие от Cry-токсинов, способны вызывать лизис многих типов клеток, что обусловлено их структурой, т. к. у них не найден специфический домен, ответственный за связывание со строго определенным типом рецепторов, а механизм их действия отличен от такового у Cry-токсинов (Schnepf et al., 1998). Кроме этого, в последние годы вызывают пристальное внимание ученых особые белки, относящиеся к Cyt-семейству, которые были названы параспоринами (параспорин-1 и параспорин-2). Для параспоринов характерно то, что они не являются инсектицидными белками, но обладают активностью в отношении клеток позвоночных животных, в частности, млекопитающих (Katayama et al., 2007), а также специфически распознают и уничтожают клетки раковых опухолей печени и толстой кишки человека и определенные типы нормальных клеток человека (Kitada et al., 2006).

Следует отметить, что термин "токсины" по отношению к пестицидным белкам, продуцируемым ВТ, употребляется в широком смысле, в т. ч. и для обозначения внутриклеточных параспоральных кристаллических включений. Это не совсем корректно, поскольку белки в составе кристаллических включений представляют собой протоксины, т. е. неактивную форму, из которой в кишечнике беспозвоночных путем ограниченного протеолиза образуется активный токсин.

В общем виде процесс действия д-эндотоксинов Cry-семейства на клетки кишечного эпителия насекомых, в соответствии с наиболее распространенной моделью, можно представить как последовательность следующих этапов (Schnepf et al., 1998; Pigott, Ellar, 2007; Soberon, Bravo, 2008):

    1) Растворение кристаллических включений, содержащих молекулы протоксина, в кишечнике насекомых за счет особых условий в нем (определенный рН, присутствие кишечных ферментов). 2) Активация токсина: процесс превращения протоксина (неактивной формы) в токсин (активная форма) путем частичного протеолиза под воздействием протеаз кишечного сока насекомых. При этом отщепление полипептидных фрагментов, не входящих в состав зрелого токсина, может происходить для различных токсинов либо с N-, либо с С-конца молекулы протоксина (Лосева и др., 1996). 3) Связывание активного токсина с первым специфическим рецептором на мембране щеточной каемки кишечного эпителия (самый распространенный класс рецепторов - кадгериновые рецепторы). 4) Дальнейшее конформационное изменение молекулы токсина, индуцированное контактом с первым специфическим рецептором, приводит к отщеплению небольшого фрагмента с N-конца молекулы - б-спирали 1.Это отщепление делает открытыми гидрофобные области домена I, которые ранее были обращены вовнутрь и, таким образом, закрыты, а также инициирует формирование из четырех таких молекул токсина единой тетрамерной структуры. 5) Олигомерная структура (тетрамер), обладая повышенным сродством ко второму специфическому рецептору, аминопептидазе N (APN), эффективно связывается с ним. Аминопептидаза N способствует встраиванию олигомерной структуры в мембрану клетки, в результате чего формируется пора. 6) На последнем этапе протекают процессы, приводящие к гибели клетки: осмотический шок и лизис клеток вследствие свободного прохождения воды и растворенных веществ через поры, а также, в соответствии с другими моделями (Pigott, Ellar, 2007), в результате предшествующей инициации серии определенных внутриклеточных сигналов, приводящих к запуску процесса гибели клетки.

Описанная выше модель действия Cry-токсинов на клетки кишечного эпителия насекомых получила название модели Bravo (Pigott, Ellar, 2007), по фамилии ученого, ее предложившего и обосновавшего. Схема взаимодействия д-эндотоксина с клеткой-мишенью на примере белка Cry1A (Soberon, Bravo, 2008) в соответствии с этой моделью показана на рис.5.

схема действия д-эндотоксина на клетку-мишень на примере cry1а токсина по модели bravo (по soberon, bravo, 2008)

Рис.5. Схема действия д-эндотоксина на клетку-мишень на примере Cry1А токсина по модели Bravo (По Soberon, Bravo, 2008)

В соответствии с моделью Bravo при формировании в мембране одной клетки двухсот или даже менее таких литических пор, имеющих радиус 0,5-1нм, происходит очень быстрое изменение мембранного потенциала клетки, выравнивание концентрации ионов по обе стороны мембраны, приток воды в клетку, ее разбухание и, в итоге, лизис (Pigott, Ellar, 2007). Таким образом, собственно механизм цитоцидного действия д-эндотоксинов - осмотический лизис.

Интересно отметить, что на активность инсектицидных токсинов BT могут оказывать действие протеазы кишечника насекомых. При этом для различных токсинов их действие может быть различным, усиливающим или ингибирующим. В частности, для токсина Cry1Ab показано, что протеолитическое отщепление фрагментов мембранными протеазами снижает уровень его активности (Fortier et al., 2007). Еще один факт, заслуживающий внимания - это двухэтапный механизм взаимодействия молекул д-эндотоксинов в составе олигомера со вторичным рецептором - APN. Было установлено (Cooper et al., 1998), что первая стадия взаимодействия является быстрой и обратимой, может ингибироваться определенными сахарами и реагентами, используемыми для разрыва белок-белковых взаимодействий. Вторая стадия - медленная и необратимая, не ингибируется указанными веществами. В случае использования мутантного штамма BT, продуцирующего измененный Cry1Ac токсин, способный связываться с APN на первой, но не на второй стадии, было показано снижение его уровня активности по отношению к личинкам Manduca Sexta (Cooper et al., 1998). Это может дать представление об одном из возможных путей возникновения устойчивости насекомых к д-эндотоксинам.

Всего существуют три модели механизма цитоцидного действия д-эндотоксинов на клетки кишечного эпителия насекомых, которые являются не взаимоисключающими, а взаимодополняющими. Помимо вышеупомянутой модели Bravo существуют модели Zhang и Jurat-Fuentes (Pigott, Ellar, 2007).

Согласно модели Zhang, токсичность Cry-протеинов определяется не только способностью вызывать осмотический лизис клетки. В этом случае мономерный Cry-токсин, связываясь с первичным рецептором, инициирует - зависимый каскадный сигнальный путь, который влечет за собой стимуляцию белка G, аденилатциклазы, повышает уровень цАМФ и активирует протеинкиназу А, что приводит к дестабилизации цитоскелета и ионных каналов и влечет за собой гибель клетки (Zhang et al., 2006).

Модель Jurat-Fuentes, по сути дела, объединяет в себе две вышеупомянутые модели, подразумевая, что цитотоксичность д-эндотоксинов зависит как от эффекта осмотического лизиса, так и от инициации специального внутриклеточного сигнального пути. Разница заключается лишь в том, что, в отличие от модели Zhang, автор полагает, что сигнальный путь регулируется фосфатазами, а также взаимодействием токсина с актином, входящим в состав цитоскелета и взаимодействующим с молекулой кадгерина. В отличие от модели Bravo, олигомерный токсин взаимодействует не только с APN, но и с другими определенными классами рецепторов (Pigott, Ellar, 2007).

Помимо рассмотренных механизмов действия д-эндотоксинов, заслуживают внимания данные о том, что д-эндотоксины BT способны в 2-5 раз снижать сопротивление искусственных фосфолипидных мембран, причем эта способность прямо пропорциональна концентрации токсина, а методами ИК - и ЯМР-спектроскопии обнаружено, что эндотоксин является потенциальным природным разобщителем-протонофором из-за наличия большого количества лабильных протонов (Каменек и др., 2008). Представляют также интерес сведения о системном эффекте д-эндотоксинов в гемоцеле насекомых: ряд Cry-токсинов способен при введении их в гемоцель вызывать быстрый паралич и смерть личинок насекомых, при более низких концентрациях приводит к различным нарушениям при окукливании, а при воздействии на культуру нервных клеток насекомых, полученную из клеток надглоточного ганглия, вызывать лизис и гибель нейронов (Cerstiaens et al., 2001). биопестицид трансгенный патоген токсин

Токсины семейств Vip и Cyt также разрушают клетки по механизму осмотического лизиса, формируя в мембране поры, хотя для некоторых Cyt-токсинов не доказано формирование пор в мембране при их взаимодействии с клеткой. Но сами способы связывания с мембраной и образования в ней каналов, приводящих к осмотическому лизису, отличаются от таковых для Cry-токсинов (Schnepf et al., 1998; Lee et al., 2003).

Уже упоминавшиеся параспорины, специфически воздействующие на раковые клетки и ряд типов нормальных клеток человека, обладают отличным от д-эндотоксинов механизмом действия. Так, действие на клетку

Параспорина-1 приводит к быстрому возрастанию внутриклеточной концентрации, что ведет к активации сигнального пути апоптоза, при этом была обнаружена активация G-белка и каспазы, специфического фермента апоптоза (Katayama et al., 2007). Параспорин-2 действует как цитолизин, обуславливая морфологические изменения всей клетки в целом и ее цитоскелета, фрагментацию митохондрий и эндоплазматического ретикулума, а также увеличение проницаемости клеточной мембраны с последующим выходом из клетки большинства цитоплазматических белков (Kitada et al., 2006).

Похожие статьи




Механизм действия токсинов - Характеристика пестицидных белков Bacillus thuringiensis и их генетических детерминант

Предыдущая | Следующая