Токсины Bacillus thuringiensis, Общая характеристика и структура токсинов - Характеристика пестицидных белков Bacillus thuringiensis и их генетических детерминант

Общая характеристика и структура токсинов

Токсины, продуцируемые BT, представляют собой белки с молекулярной массой от 130 до 140 кДа либо около 70 кДа для Сry-токсинов (Pigott, Ellar, 2007), 100 или 88 кДа для Vip-токсинов(Lee et al., 2003), 26-28 либо 60 кДа для Cyt-токсинов (Manasherob et al., 2003).

группы cry- и cyt-белков, выделенные на основании сходства их аминокислотных последовательностей и представленные графически в виде радиальной филлограммы

Рис.1. Группы Cry - и Cyt-белков, выделенные на основании сходства их аминокислотных последовательностей и представленные графически в виде радиальной филлограммы. Группы сходства заштрихованы. (По Schnepf et al., 1998, на основании данных Crickmore et al., 1998)

Принятая в настоящее время классификация токсинов основана на степени сходства их консервативных аминокислотных последовательностей, первичной и вторичной структуры (Crickmore et al., 1998; Schnepf et al., 1998), что отражает эволюционную дивергенцию между подвидами и штаммами. (Добрица и др., 2001) В соответствии с этим выделяют два мультигенных семейства токсинов: Cry и Cyt (рис.1) (Crickmore et al., 1998)

Следует отметить, что эта система классификации касается тех токсинов, которые продуцируются в период стационарной фазы роста популяции бактериальных клеток, в зависимости или независимо от процесса споруляции, и формируют параспоральные кристаллические включения внутри клетки (рис.2). Таким образом, эти белки следует относить к эндотоксинам.

клетка bacillus thuringiensis subsp

Рис.2. Клетка Bacillus thuringiensis Subsp. Israelensis после споруляции (А) и ее типичное параспоральное тельце с указанием взаиморасположения в нем включений индивидуальных токсинов (В). Sp - спора, Е - экзоспориум, РВ - параспоральное тельце (По Federici et al., 2003)

Протеины групп Cry1, Cry2 и Cry9 токсичны для насекомых отряда Чешуекрылые, а групп Cry3, Cry7 и Cry8 - для представителей отряда Жесткокрылые. Токсины групп Cry2, Cry4, Cry10, Cry11, Cry16, Cry17, Cry19 и Cyt активны в отношении видов отряда Двукрылые, а Cry5, Cry12, Cry13 и Cry14 обладают нематоцидным действием (Bravo et al., 1998).

Однако эндотоксины Cry - и Cyt-семейств - далеко не единственные факторы, обусловливающие пестицидную активность ВТ: определенный вклад вносят также фосфолипазы, протеазы, хитиназы, продуцируемые ВТ, а также пестицидные белки (VIP-белки), продуцируемые некоторыми штаммами ВТ на протяжении фазы вегетативного роста (Добрица и др., 2001; Schnepf et al., 1998). Аббревиатура VIP (vegetative insecticidal protein) отражает особенности их синтеза (во время периода вегетативного роста), хотя при таком рассмотрении данный термин не вполне корректен, поскольку некоторые Cry-токсины также продуцируются в фазе вегетативного роста (Schnepf et al., 1998). В связи с широким и длительным использованием биопестицидов на основе именно д-эндотоксинов и приобретением многими видами насекомых устойчивости к ним (Tabashnik, 1997; Onstad, 2008), подробное изучение VIP-токсинов перспективно в плане их использования как альтернативы препаратам на основе Cry-протеинов. VIP-протеины не обнаруживают никакого сходства по первичной, вторичной и третичной структуре с белками семейств Cry и Cyt, для них существует отдельная номенклатура, в соответствии с которой они объединены в 3 семейства: Vip1, Vip2, Vip3. Белки Vip1 и Vip2 - компоненты бинарного токсина, активного в отношении представителей отряда Coleoptera (Rang et al., 2005).

трехмерная кристаллическая структура cry-токсинов на примере cry3aa и cry1aa. домен i показан красным цветом, домен ii - зеленым, домен iii - синим. (по pigott, ellar, 2007)

Рис.3. Трехмерная кристаллическая структура Cry-токсинов на примере Cry3Aa и Cry1Aa. Домен I показан красным цветом, домен II - зеленым, домен III - синим. (По Pigott, Ellar, 2007)

Все токсины Cry-семейства - белки, состоящие из трех основных функционально значимых единиц - доменов. Каждый домен имеет специфический аминокислотный состав, вторичную и третичную структуру (рис.3).

Домен I представляет собой связку б-спиралей, в которой шесть спиралей окружают одну центральную спираль. Каждая из этих шести внешних спиралей имеет амфипатическую природу (т. е. имеет и гидрофильную, и гидрофобную части). Заряженные или полярные остатки, как правило, расположены на тех частях домена, которые контактируют с растворителем, а гидрофобные остатки, обычно ароматической природы, находятся на частях, обращенных к центральной б-спирали. Полярные группы представлены в межспиральном пространстве, но все они участвуют в образовании водородных связей или солевых мостиков (Schnepf et al., 1998; Pigott, Ellar, 2007). Следует отметить, что структура домена I сходна с таковой у порообразующего домена колицина. Домен I - главный детерминант процесса образования пор в плазматической мембране, например, мембране ворсинок эпителиальных клеток кишечника насекомых, он способен встраиваться в липидный бислой мембраны, пронизывая его (Schnepf et al., 1998; Pigott, Ellar, 2007).

Домен II образован тремя антипараллельными в-слоями, упакованными воедино так, что они формируют в-призму с псевдотрехлучевой симметрией. Два из этих слоев обращены по направлению к окружающему молекулу токсина растворителю (т. е. наружу), а третий располагается рядом с доменом I. По своей структуре домен II проявляет наибольшую вариабельность среди всех трех доменов Cry-токсинов, это особенно справедливо для трех верхушечных петель домена II, структура и роль которых в настоящее время интенсивно изучаются (Pigott et al., 2008). Домен II играет главную роль в определении специфичности действия токсина, связываясь с определенным рецептором на плазматической мембране (Schnepf et al., 1998; Pigott, Ellar, 2007). Важная роль петель в специфическом связывании токсина была, например, подтверждена путем мутагенеза в последовательности размером 30 нуклеотидов, которая кодирует последовательность аминокислот домена II, при этом лишь мутации, затрагивающие сериновые остатки, расположенные в области петель, приводили к выраженному снижению токсичности продукта такого мутантного гена для личинок насекомых (Aronson et al., 1995). Направленный мутагенез был использован и для редизайна CryIAa токсина, активного в отношении гусениц-вредителей, в токсин, действующий против москитов (Liu, Dean, 2006). Это было сделано путем делеций и замены нуклеотидов в последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность петли домена II.

Домен III сформирован "сэндвичем" из двух антипараллельных в-слоев, в котором внешний слой обращен к окружающему молекулу белка растворителю, а внутренний располагается рядом с доменом II. Две длинные петли отходят от одного конца домена III и взаимодействуют с доменом I. Домен III с отходящими от него петлями образует уникальный сайт связывания с определенными углеводами, на основании чего полагают, что он усиливает действие токсина путем повышения его эффективной концентрации на поверхности субстрата, т. е. плазматической мембраны (Schnepf et al., 1998; Pigott, Ellar, 2007).

трехмерная структура cyt-токсинов на примере cyt2a (по schnepf et al., 1998)

Рис.4. Трехмерная структура Cyt-токсинов на примере Cyt2A (По Schnepf et al., 1998)

Что касается структуры Cyt-токсинов, то они, в отличие от Cry-токсинов, состоят из единственного домена (рис.4), в котором два внешних слоя б-спиралей окружают смешанный в-слой (Schnepf et al., 1998).

Нельзя не обратить внимание на тот факт, что положение определенных аминокислотных остатков в доменах молекул токсинов является консервативным и функционально важным, например, для Cry-протеинов выявлены восемь остатков триптофана, замена которых на другие аминокислотные остатки путем сайт-специфического мутагенеза соответствующих Cry-генов приводит к снижению токсичности таких мутантных белков для насекомых (Padilla et al., 2006).

Похожие статьи




Токсины Bacillus thuringiensis, Общая характеристика и структура токсинов - Характеристика пестицидных белков Bacillus thuringiensis и их генетических детерминант

Предыдущая | Следующая