Генетические методы изучения биопленок - Использование микробных биопленок в промышленности

Для выявления генов, участвующих в генетическом контроле любого процесса, используются методы направленного и ненаправленного (инсерционного) мутагенезов. Для выяснения механизмов инициации образования биопленок R. Kolter с соавт. описали мутанты, дефектные в отношении образования биопленок, полученные с помощью транспозонного мутагенеза, у P. aeruginosa и Е. coli. При использовании данного метода вначале получают большое количество инсерционных мутантных клонов и подвергают их тотальной проверке на способность к образованию биопленок в сравнении со штаммом, используемым в качестве исходного для мутагенеза.

В работе J. J. Dennis и G. J. Zylstra в качестве мигрирующего генетического элемента был использован пласпозон - плазмида, в состав которой входит транспозон с антибиотико-устойчивой кассетой. Пласпозон способен полностью встраиваться в любое место хромосомы, нарушая последовательность гена и приводя к инсерционной мутации в этом гене.[14]

Инсерция пласпозона в геном исходного штамма может привести к нарушению работы как генов, кодирующих транскрипционные регуляторы, так и любых других генов, и как следствие - к усилению или уменьшению способности бактерий к образованию биопленок. С помощью этого метода была показана роль генов cepl-cepR в QS-регуляции у В. cepacia.

Другой подход для изучения генов, контролирующих развитие биопленок у P. aeruginosa, был использован А. Finelli с соавт, которые использовали систему исследования генов, экспрессируемых в зрелой биопленке. В основе метода лежит использование мутанта-ауксотрофа со строгой питательной потребностью, позволяющего отбирать активные промоторы в биопленках, способные восстановить прототрофность у мутанта.[9]

Для определения факторов, влияющих на трехмерную структуру и, следовательно, на устойчивость биопленки к механическому повреждению, индивидуальные клетки должны быть помечены таким образом, чтобы их можно было визуализировать с применением эпифлюоресценции или КСЛМ. Метод мечения включает помещение последовательности ДНК, которая кодирует флуоресцентную метку, например такую, как зеленый флуоресцентный белок (green fluorescence protein - GFP), в хромосому бактерии с помощью плазмидного вектора. Для флуоресценции GFP не требуется каких-либо кофакторов или субстратов и, следовательно, возможно непосредственное in vivo наблюдение экспрессии GFP в индивидуальных клетках, клеточных популяциях или даже в целых организмах в режиме реального времени. GFP и его аналоги представляют собой исключительно удобные белки-репортеры для анализа экспрессии генов.[3]

Известно, что инсерция в хромосому обеспечивает стабильность в поддержании гена gfp, однако, при этом существует риск нарушения нормальной генной экспрессии в области инсерции, так как ген gfp может встроиться в любое место в хромосоме. В этом случае gfp может быть использован как репортерный ген.

Столь же эффективным, но менее разрушительным, является метод использования плазмидного экспрессионного вектора, безопасно обеспечивающего клетку геном флуоресцентного белка, который используется в генно-инженерных конструкциях, применяемых для исследования экспрессии генов в живых тканях и микроорганизмах in vivo (например, при идентификации бактериальных генов с помощью метода замены генов - gene replacement).[7]

В литературе описано множество подобных GFP экспрессионных векторов, однако только несколько из них применимы для использования в изолятах комплекса В. cepacia. M. D. Levebre и М. А. Valvano описали новые GFP-векторы для исследования регуляции генной экспрессии у В. cenocepacia, но они не были протестированы для использования в биопленках, в которых питательные вещества, pH и кислородный градиент могли отрицательно влиять на экспрессию или фолдинг GFP. С недавних пор для исследований структуры биопленок используют GFP-экспрессионный вектор, содержащий гентамиции-устойчивую кассету для мечения штамма В. cenocepacia HI 11 (5. cepacia геномовар III).[6]

Изменения в метаболизме бактерий при их переходе к прикрепленному образу жизни изучались путем сравнительного анализа состава мРНК и белков в клетках планктонных и биопленочных бактерий. Эти исследования наряду с микроскопическими наблюдениями позволили описать различные стадии развития биопленок, в том числе их прикрепление к субстрату, образование микроколоний и каналов, созревание биопленок, а затем и дисперсию клеток.

Для выявления степени различий в экспрессии генов и, соответственно, в белковых составах клеток на разных стадиях развития биопленки применяют протеомный анализ. При этом выращенные бактерии после центрифугирования и промывания для удаления среды выращивания подвергают одномерному электрофорезу[8]. Преимущество одномерного фореза состоит в том, что белковый портрет культуры получается более полным, чем при двухмерном, при котором обработка культуры приводит к потере некоторых мембранных фракций. Далее получают протеомные карты посредством двухмерного гель - электрофореза и MALDI-TOF-масс-спектрометрии, основанной на лазерной десорбции и ионизации макромолекул, опосредованной матриксом и детекторами ионов, которые позволяют определять время их полета.[4]

В этом методе импульсное облучение сорбента, с которым связаны анализируемые макромолекулы, приводит к их эффективной фрагментации и десорбции в вакуум благодаря избирательному поглощению сорбентом энергии света. При этом время полета образовавшихся ионов в анализаторе прямо пропорционально их массе. Данный метод позволяет проводить сравнительный анализ белковых профилей различных мутантных штаммов, что дает возможность определить, каково влияние исследуемой мутации на экспрессию других генов и на генетический контроль изучаемого процесса, в котором эти гены участвуют.[10]

Похожие статьи




Генетические методы изучения биопленок - Использование микробных биопленок в промышленности

Предыдущая | Следующая