Генетические методы изучения биопленок - Использование микробных биопленок в промышленности
Для выявления генов, участвующих в генетическом контроле любого процесса, используются методы направленного и ненаправленного (инсерционного) мутагенезов. Для выяснения механизмов инициации образования биопленок R. Kolter с соавт. описали мутанты, дефектные в отношении образования биопленок, полученные с помощью транспозонного мутагенеза, у P. aeruginosa и Е. coli. При использовании данного метода вначале получают большое количество инсерционных мутантных клонов и подвергают их тотальной проверке на способность к образованию биопленок в сравнении со штаммом, используемым в качестве исходного для мутагенеза.
В работе J. J. Dennis и G. J. Zylstra в качестве мигрирующего генетического элемента был использован пласпозон - плазмида, в состав которой входит транспозон с антибиотико-устойчивой кассетой. Пласпозон способен полностью встраиваться в любое место хромосомы, нарушая последовательность гена и приводя к инсерционной мутации в этом гене.[14]
Инсерция пласпозона в геном исходного штамма может привести к нарушению работы как генов, кодирующих транскрипционные регуляторы, так и любых других генов, и как следствие - к усилению или уменьшению способности бактерий к образованию биопленок. С помощью этого метода была показана роль генов cepl-cepR в QS-регуляции у В. cepacia.
Другой подход для изучения генов, контролирующих развитие биопленок у P. aeruginosa, был использован А. Finelli с соавт, которые использовали систему исследования генов, экспрессируемых в зрелой биопленке. В основе метода лежит использование мутанта-ауксотрофа со строгой питательной потребностью, позволяющего отбирать активные промоторы в биопленках, способные восстановить прототрофность у мутанта.[9]
Для определения факторов, влияющих на трехмерную структуру и, следовательно, на устойчивость биопленки к механическому повреждению, индивидуальные клетки должны быть помечены таким образом, чтобы их можно было визуализировать с применением эпифлюоресценции или КСЛМ. Метод мечения включает помещение последовательности ДНК, которая кодирует флуоресцентную метку, например такую, как зеленый флуоресцентный белок (green fluorescence protein - GFP), в хромосому бактерии с помощью плазмидного вектора. Для флуоресценции GFP не требуется каких-либо кофакторов или субстратов и, следовательно, возможно непосредственное in vivo наблюдение экспрессии GFP в индивидуальных клетках, клеточных популяциях или даже в целых организмах в режиме реального времени. GFP и его аналоги представляют собой исключительно удобные белки-репортеры для анализа экспрессии генов.[3]
Известно, что инсерция в хромосому обеспечивает стабильность в поддержании гена gfp, однако, при этом существует риск нарушения нормальной генной экспрессии в области инсерции, так как ген gfp может встроиться в любое место в хромосоме. В этом случае gfp может быть использован как репортерный ген.
Столь же эффективным, но менее разрушительным, является метод использования плазмидного экспрессионного вектора, безопасно обеспечивающего клетку геном флуоресцентного белка, который используется в генно-инженерных конструкциях, применяемых для исследования экспрессии генов в живых тканях и микроорганизмах in vivo (например, при идентификации бактериальных генов с помощью метода замены генов - gene replacement).[7]
В литературе описано множество подобных GFP экспрессионных векторов, однако только несколько из них применимы для использования в изолятах комплекса В. cepacia. M. D. Levebre и М. А. Valvano описали новые GFP-векторы для исследования регуляции генной экспрессии у В. cenocepacia, но они не были протестированы для использования в биопленках, в которых питательные вещества, pH и кислородный градиент могли отрицательно влиять на экспрессию или фолдинг GFP. С недавних пор для исследований структуры биопленок используют GFP-экспрессионный вектор, содержащий гентамиции-устойчивую кассету для мечения штамма В. cenocepacia HI 11 (5. cepacia геномовар III).[6]
Изменения в метаболизме бактерий при их переходе к прикрепленному образу жизни изучались путем сравнительного анализа состава мРНК и белков в клетках планктонных и биопленочных бактерий. Эти исследования наряду с микроскопическими наблюдениями позволили описать различные стадии развития биопленок, в том числе их прикрепление к субстрату, образование микроколоний и каналов, созревание биопленок, а затем и дисперсию клеток.
Для выявления степени различий в экспрессии генов и, соответственно, в белковых составах клеток на разных стадиях развития биопленки применяют протеомный анализ. При этом выращенные бактерии после центрифугирования и промывания для удаления среды выращивания подвергают одномерному электрофорезу[8]. Преимущество одномерного фореза состоит в том, что белковый портрет культуры получается более полным, чем при двухмерном, при котором обработка культуры приводит к потере некоторых мембранных фракций. Далее получают протеомные карты посредством двухмерного гель - электрофореза и MALDI-TOF-масс-спектрометрии, основанной на лазерной десорбции и ионизации макромолекул, опосредованной матриксом и детекторами ионов, которые позволяют определять время их полета.[4]
В этом методе импульсное облучение сорбента, с которым связаны анализируемые макромолекулы, приводит к их эффективной фрагментации и десорбции в вакуум благодаря избирательному поглощению сорбентом энергии света. При этом время полета образовавшихся ионов в анализаторе прямо пропорционально их массе. Данный метод позволяет проводить сравнительный анализ белковых профилей различных мутантных штаммов, что дает возможность определить, каково влияние исследуемой мутации на экспрессию других генов и на генетический контроль изучаемого процесса, в котором эти гены участвуют.[10]
Похожие статьи
-
Методы выявления биопленок - Использование микробных биопленок в промышленности
В настоящее время наиболее надежным методом подтверждения наличия микробной биопленки является специальная микроскопия. В первую очередь это конфокальное...
-
ЗАКЛЮЧЕНИЕ - Использование микробных биопленок в промышленности
Итак бактериальные биопленки представляют собой организованные сообщества микроорганизмов, которые состоят из внеклеточного матрикса, производимом же...
-
ВВЕДЕНИЕ - Использование микробных биопленок в промышленности
Все знания о морфологии, физиологии, генетике, адаптационных возможностях бактерий были получены при изучении планктонных форм бактерий. В настоящее...
-
Методы культивирования биопленок В последнее десятилетие произошло значительное расширение возможности изучения формирования микробных биопленок....
-
Механизмы и этапы формирования биопленок Биопленка - микробное сообщество, характеризующееся клетками, которые прикреплены к поверхности или друг к...
-
Основные методы, которые были использованы при исследовании видов рода Amanita Fr. - это среднемасштабный маршрутный метод исследования микобиоты и...
-
Ионизирующим излучением называется любое излучение, прямо или косвенно вызывающее ионизацию среды. Ионизирующее излучение бывает электромагнитным и...
-
Поскольку биопленки, как правило, представляют собой гетерогенные сообщества, состоящие из микроорганизмов разных физиологических групп, необходимо...
-
Ультраструктура биопленок - Использование микробных биопленок в промышленности
С помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии показано, что биопленки - не структурно гомогенные монослои микробных клеток на поверхности....
-
Материал исследования Исследования проводили в период вегетативного сезона 2011-2015 гг. Сбор осуществляли преимущественно маршрутным методом. В ходе...
-
В настоящее время в систематике бактерий осуществляется пересмотр сложившихся представлений, который благодаря своему бурному характеру и значению...
-
Не существует таких явлений природы, технических или социальных процессов, которые были бы предметом изучения математики, но при этом не относились бы к...
-
Б. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТКИ - Основные положения учения о клетке
1) Методы исследования структурной организации клетки. Световая микроскопия. * Получение четких изображений мелких (недоступных человеческому глазу)...
-
Метод исследования в свете люминесценции - Методы изучения клетки
Метод Исследования в свете люминесценции состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их...
-
Поляризационная микроскопия, Метод фазового контраста - Методы изучения клетки
Поляризационная микроскопия - это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически...
-
Методы сбора и учета численности летающих насекомых - Изучение лесных беспозвоночных
Существует множество методик лова летающих беспозвоночных животных, однако практически ни одна из них не дает данных о плотности населения животных на...
-
Общие методы изучения вирусов - Строгие постулаты Коха
О присутствии вируса в организме как при спонтанном заболевании, так и при экспериментальном заражении хозяина судят по появлению тех или иных...
-
Энзимотерапия - Использование ферментов в медицинской практике в качестве лекарственных средств
Энзимотерапия - это использование ферментов в качестве лекарственных средств. Использование ферментов в качестве терапевтических средств имеет много...
-
Кровь убойных животных - один из важнейших источников высокоценного животного белка. Ее высокая пищевая ценность обусловлена значительным содержанием...
-
Масляно-кислое брожение -- это сложный биохимический процесс превращения сахара масляно-кислыми бактериями в анаэробных условиях с образованием масляной...
-
Для расчета контраста изображений кристаллических тел, имеющих регулярные структуры, а также для решения обратной задачи -- расчета структуры объекта по...
-
Биологическими маркерами принято считать устойчивые биохимические, физиологические, анатомические и иные признаки организмов, варьирующие в норме в...
-
В настоящее время оценка генетической структуры различных популяций осуществляется с использование биологических и небиологических источников информации,...
-
Методы сбора и учетов численности беспозвоночных в кронах - Изучение лесных беспозвоночных
Среда обитания беспозвоночных, условно называемая нами "кроны", включает в себя ветви кустарников и деревьев, независимо от их размеров и высоты...
-
Если возбуждение нейронов, активировавшихся при восприятии нами информации из внешней среды, поддерживается длительно, то сигнал доходит до их ядер и...
-
Микроскопический метод исследования предусматривает наблюдение за живыми и убитыми микробами в окрашенном и неокрашенном состоянии. Различают простые и...
-
Метод темного поля и его разновидности - Методы изучения клетки
Метод темного поля в проходящем свете используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые не могут быть видны, если...
-
Метод микрофигурии - Методы изучения клетки
С помощью микроманипулятора отдельные части клетки можно удалять, добавлять или каким-то образом видоизменять. Крупную клетку амебы удается разделить на...
-
Простой метод окраски, Сложные методы окраски - Изучение морфологии микроорганизмов
Препарат помещают на подставку для окраски, исследуемым материалом вверх. Пипеткой наносят на него раствор красителя. По истечении указанного времени...
-
ВВЕДЕНИЕ Близнецовый психогенетический наследственность генотип Психогенетика - наука о наследственности и изменчивости психических свойств, возникшая на...
-
Факторы популяционной динамики, Инбридинг - Генетические процессы в популяциях
Инбридинг Понятие "инбридинг" широко используется в популяционной генетике при описании особенностей генетической структуры популяций. Случайное...
-
Методы биологических исследований - Аналогия и моделирование в биологических исследованиях
Когда мы говорим о биологии, мы говорим о науке, которая занимается исследованием всего живого. Все живые существа, включая ареал их обитания, изучаются....
-
Методы и организация исследования Анализ литературных источников проводился на всех этапах исследования. Анализ специальной научно-методической...
-
Общенаучные методы исследования - Методология научного исследования в естествознании
Процесс познания как основа любого научного исследования представляет собой сложный диалектический процесс постепенного воспроизведения в сознании...
-
Материал и методы исследования - Фауна рыб нижнего течения реки Гайва
Материал для данной работы был собран на р. Гайва Пермского края в весеннее-летне-осенний период с 6 мая по 11 сентября 2015 года, как во время...
-
Система методов технических медицинских исследований - Научные основы приборостроение в медицине
Инструментальные средства медико-биологических исследований представляют собой совокупность приборов, аппаратов, систем, комплексов и приспособлений к...
-
Развитие микробиологии определялось конкретными историческими условиями: развитием социально - экономической основы общества, обусловленным ростом...
-
Методы исследования Испытуемым на первом этапе было предложено ответить на вопросы о заинтересованности в психотерапии: - Хотите ли Вы обратиться к...
-
Комбинированное использование лечебно-диагностических систем в эндоскопической хирургии
В настоящем литературном обзоре обсуждается ряд вопросов, посвященных использованию криохирургического способа в экспериментальной и клинической...
-
Введение - Молекулярная и генетическая организация плазмид
Плазмиды - внехромосомные генетические элементы, способные к автономному поддержанию в цитоплазме бактерий или существованию в нтегрированном в хромосому...
Генетические методы изучения биопленок - Использование микробных биопленок в промышленности