Методы выявления биопленок - Использование микробных биопленок в промышленности
В настоящее время наиболее надежным методом подтверждения наличия микробной биопленки является специальная микроскопия. В первую очередь это конфокальное лазерное сканирующее микроскопическое исследование. [12]
Принцип действия микроскопа заключается в том, что рефлексируемое изображение, получаемое через объективы в результате преломления по системе зеркал, поступает на детектор, который обрабатывает приходящие лучи, составляя изображение, передаваемое на монитор компьютера. При помощи движения лазерного луча происходит послойное сканирование исследуемого объекта. Изображение, получаемое на мониторе CLSM по отношению к световому микроскопу, имеет зеркальное отображение под углом 90°. [11]
Объемное изображение в LSCM получается при помощи регистрации флуоресценции в фокусе лазерного луча. Излучаемые фотоны фокусируются объективом на небольшом отверстии, которое ослабляет флуоресцентный сигнал от участков, находящихся не в фокусе.
Применение конфокальной сканирующей лазерной микроскопии для исследования биопленок радикально изменило восприятие их структурных и функциональных особенностей. Этот метод дал возможность исследовать биопленки in situ без ограничений, с которыми сталкивается электронная микроскопия(технология подготовки образцов приводила к их обезвоживанию и разрушению,[10] хотя и при более низких увеличениях. С помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии показано, что биопленки - не структурно гомогенные монослои микробных клеток на поверхности. Скорее они могут быть описаны как гетерогенные во времени и в пространстве структуры, однако основная структура сообщества универсальна, с некоторыми незначительными вариациями. [2]
Оценить значение ЛСКМ в современных методах изучения биопленок можно на примере работы И. В. Чеботарь с со авт. "Современные технологии исследования бактериальных биопленок".
Объектом исследования был придонный слой бульонной культуры клинического изолято коагулазопозитивного стафилококка.
Микроскопическое исследование проводили с помощью лазерного сканирующего (конфокального) микроскопа LSM 510 Meta. Непосредственно в чашке Петри слой стафилококков окрашивали флюорохромными красителями. Полученные изображения реконструировали и анализировали при помощи компьютерной программы Zeiss LSM Image Browser. Визуализация биопленки с помощью конфокальной выявила характерную для биопленок трехмерную. Толщина двухсуточной биопленки S. aureus колебалась от 20 до 47 мкм.[15]
Отдельная серия микроскопических исследований подвижности биопленочных стафилококков (с аналогичной флюорохромной окраской) была проведена с применением технологии "резонансный сканер" на лазерном сканирующем (конфокальном) микроскопе TCS; изображения были восстановлены при помощи программного обеспечения LAS AF Lite. Микроскопическое наблюдение за живой биопленкой в режиме реального времени позволило обнаружить особый вид хаотического (теплового) движения стафилококков, находящихся в ее составе. Некоторые стафилококки, являясь микроскопическими частицами, совершали хаотические колебания внутри ограниченного объема, соизмеримого с их размерами. При этом стафилококки могли не иметь прямых контактов с соседними клетками. В отличие от классического броуновского движения перемещения стафилококков были ограничены. Это свидетельствовало о том, что стафилококки механически связаны между собой, и являлось косвенным подтверждением существования необходимого атрибута любой биопленки -- внеклеточного матрикса, связывающего биопленочные микробы между собой и с подлежащей поверхностью.[10]
Для ультраструктурных исследований рельефа биопленки использовали сканирующий электронный микроскоп JSM 6390А. Фиксацию препарата осуществляли при 4оС в два этапа. Вначале проводили предфиксацию (30 мин) образца в 2,5% растворе глутарового альдегида (рН=7,2) с последующим троекратным отмыванием дистиллированной водой. Затем препарат фиксировали (30 мин) 0,5% раствором OsO4 с последующим троекратным отмыванием в дистиллированной воде. После этого препарат криофиксировали в жидком азоте (-196°С) и подвергали низкотемпературной дегидратации (-100°С) в высоком вакууме в течение 24 ч. После лиофилизации препарат монтировали на держатель электронного микроскопа и на его поверхность методом ионного распыления в аргоновой плазме наносили слой платины (10 нм). Сканирующая электронная микроскопия проводилась при увеличении от 1000 до 10000 раз. В пространственном расположении стафилококков прослеживались два уровня организации. Первый уровень связан с тем, что стафилококки формировали кластеры, включающие от 9 до 55 клеток [2]. На более высоком уровне организации стафилококковые кластеры формировали единую надкластерную структуру, состоящую из многих слоев, -- биопленку. Массив биопленки пронизан многочисленными каналами, устья которых открывались на внешнюю (исследуемую) поверхность биопленки. Через просветы каналов не видно подложки, на которой сформировалась биопленка. На 100 мкм2 поверхности биопленки открывается в среднем от 4 до 6 устьев каналов. В образовании стенок каналов в районе устьев принимают участие от 9 до 27 стафилококков. Между стафилококками наблюдалось два типа контактов: непосредственное взаимодействие, с помощью которого формируются кластеры, и матрикс-опосредованные связи. Последние обнаруживались при увеличении от 3000 до 15 000: между отдельными стафилококками существовали необычные "перемычки" -- структуры биопленочного матрикса, связывающие бактерии друг с другом. Клеточная поверхность большинства стафилококков -- ровной округлой формы, исключения составляли участки клеточной поверхности, связанные с внеклеточным матриксом. Эта поверхность была неровной, матрикс представлял собой неструктурированную, неоформленную субстанцию. Следует отметить, что биопленочный матрикс в условиях in vitro может быть образован как активно секретируемыми бактериальными полимерами, так и дериватами клеток, полученными в результате аутолиза.[8]
Другие методы основаны на сорбции молекул красителя на структурах биопленки, с последующей их отмывкой (десорбцией) в органические растворители. Такой способ индикации биопленок наиболее часто используется в статических методах культивирования микробных биопленок и позволяет дать условную количественную характеристику образовавшимся микробным сообществам, т. е. чем больше образуется матрикс биопленки, тем больше красителя сорбируется на его поверхности и тем выше оптическая плотность образца.[5]
Подобный метод был использован в работе Л. В. Лагун с соавт.
"Интенсивность образования микробных биопленок микроорганизмами, выделнными при пиелонефритах и мочекаменной болезни"
В исследовании использовали суточные культуры микроорганизмов, выращенные на агаре Мюллера-Хинтона. Посевы инкубировали в шейкере-инкубаторе при 37 °С в течение 24 ч, после чего бульонную культуру осторожно удаляли и вносили в пробирки 1 мл 0,1% водного раствора кристаллического фиолетового для окрашивания сформированных биопленок. Окрашивание проводили при 37 °С в течение 30 мин. Далее, полностью удалив из пробирок раствор кристаллического фиолетового, проводили экстракцию красителя из биопленки в 1 мл 96% этанола в течении 1 часа при комнатной температуре.[14]
Измерение биолюминесценции (BPI) - достаточно новый метод изучения и детекции биопленок, который можно использовать как in vitro, так и in vivo. При искусственном введении в бактерии плазмид, ответственных за синтез люминесцирующего белка, можно проводить визуализацию как адгезированных бактерий, так и матрикса биопленки.
Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) также стал сравнительно недавно использоваться для изучения биопленок в медицине (этот метод часто совмещается с методом CLSM). Метод гибридизации применяют для детекции и определения расположения специфических мРНК в клетках, образующих биопленки, что позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в бактериях. С помощью этого метода была определена неоднородность бактерий в биопленке и выявлены клетки-персистеры, ответственные за выживание популяции во время воздействия летальных для основной массы клеток факторов.[9]
Все выше перечисленные методы применяются в настоящее время только для научных исследований и не адаптированы для использования в практической диагностической работе. В зарубежной практике разработаны и стандартизованы методы выявления биопленок только для небольшого числа клинически важных видов микроорганизмов.
Биопленки могут возникнуть в организме человека как в результате жизнедеятельности нормофлоры, так и в результате деятельности условно-патогенннои и патогенной микрофлоры. Бактериальные биопленки обнаружены в ротовой полости, в кишечнике, на поверхности кожи. Полезные микроорганизмы образуют организованные сообщества, так же, как и вредные микроорганизмы.
Похожие статьи
-
Генетические методы изучения биопленок - Использование микробных биопленок в промышленности
Для выявления генов, участвующих в генетическом контроле любого процесса, используются методы направленного и ненаправленного (инсерционного)...
-
ЗАКЛЮЧЕНИЕ - Использование микробных биопленок в промышленности
Итак бактериальные биопленки представляют собой организованные сообщества микроорганизмов, которые состоят из внеклеточного матрикса, производимом же...
-
Методы культивирования биопленок В последнее десятилетие произошло значительное расширение возможности изучения формирования микробных биопленок....
-
Механизмы и этапы формирования биопленок Биопленка - микробное сообщество, характеризующееся клетками, которые прикреплены к поверхности или друг к...
-
ВВЕДЕНИЕ - Использование микробных биопленок в промышленности
Все знания о морфологии, физиологии, генетике, адаптационных возможностях бактерий были получены при изучении планктонных форм бактерий. В настоящее...
-
Поскольку биопленки, как правило, представляют собой гетерогенные сообщества, состоящие из микроорганизмов разных физиологических групп, необходимо...
-
Ультраструктура биопленок - Использование микробных биопленок в промышленности
С помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии показано, что биопленки - не структурно гомогенные монослои микробных клеток на поверхности....
-
Не существует таких явлений природы, технических или социальных процессов, которые были бы предметом изучения математики, но при этом не относились бы к...
-
Ионизирующим излучением называется любое излучение, прямо или косвенно вызывающее ионизацию среды. Ионизирующее излучение бывает электромагнитным и...
-
Основные методы, которые были использованы при исследовании видов рода Amanita Fr. - это среднемасштабный маршрутный метод исследования микобиоты и...
-
Б. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТКИ - Основные положения учения о клетке
1) Методы исследования структурной организации клетки. Световая микроскопия. * Получение четких изображений мелких (недоступных человеческому глазу)...
-
Кровь убойных животных - один из важнейших источников высокоценного животного белка. Ее высокая пищевая ценность обусловлена значительным содержанием...
-
Биологическими маркерами принято считать устойчивые биохимические, физиологические, анатомические и иные признаки организмов, варьирующие в норме в...
-
Материал и методы исследования - Фауна рыб нижнего течения реки Гайва
Материал для данной работы был собран на р. Гайва Пермского края в весеннее-летне-осенний период с 6 мая по 11 сентября 2015 года, как во время...
-
Материал исследования Исследования проводили в период вегетативного сезона 2011-2015 гг. Сбор осуществляли преимущественно маршрутным методом. В ходе...
-
Исследования полостных или трубчатых органов, заключающиеся в непосредственном осмотре их внутренней поверхности с помощью особых приборов - Эндоскопов...
-
Для расчета контраста изображений кристаллических тел, имеющих регулярные структуры, а также для решения обратной задачи -- расчета структуры объекта по...
-
Масляно-кислое брожение -- это сложный биохимический процесс превращения сахара масляно-кислыми бактериями в анаэробных условиях с образованием масляной...
-
Система методов технических медицинских исследований - Научные основы приборостроение в медицине
Инструментальные средства медико-биологических исследований представляют собой совокупность приборов, аппаратов, систем, комплексов и приспособлений к...
-
Метод исследования в свете люминесценции - Методы изучения клетки
Метод Исследования в свете люминесценции состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их...
-
Комбинированное использование лечебно-диагностических систем в эндоскопической хирургии
В настоящем литературном обзоре обсуждается ряд вопросов, посвященных использованию криохирургического способа в экспериментальной и клинической...
-
Программа исследования Исследование проводилось в три этапа. На первом этапе проводился сбор и обработка информации. На втором этапе проводился анализ...
-
Ионизационное излучение не воспринимается органами чувств, следовательно, для их обнаружения используют те эффекты, которые визируют излучение на...
-
В фармацевтической практике используют высушенные, реже свежие подземные органы многолетних растений, собранные чаще осенью или ранней весной, очищенные...
-
Методы и организация исследования Анализ литературных источников проводился на всех этапах исследования. Анализ специальной научно-методической...
-
Поляризационная микроскопия, Метод фазового контраста - Методы изучения клетки
Поляризационная микроскопия - это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически...
-
Основаны на регистрации электропотенциалов или звуковых явлений, возникающих в работающем органе. Электрокардиография (ЭКГ) - Метод, основанный на...
-
Методы исследования Испытуемым на первом этапе было предложено ответить на вопросы о заинтересованности в психотерапии: - Хотите ли Вы обратиться к...
-
Методы биологических исследований - Аналогия и моделирование в биологических исследованиях
Когда мы говорим о биологии, мы говорим о науке, которая занимается исследованием всего живого. Все живые существа, включая ареал их обитания, изучаются....
-
Введение - Основные методы обследования больного при различных заболеваниях
Распознать болезнь можно, зная ее проявления, умея найти только ей присущие изменения в организме. Для обнаружения и изучения разнообразных проявлений...
-
Утрата инфекционности, Серологические методы - Строгие постулаты Коха
Как правило, чувствительность вирионов данного вируса к действию тех или иных инактивирующих веществ определяется специфическими свойствами его белков,...
-
Аускультация - Основные методы обследования больного при различных заболеваниях
Аускультация (от лат. auscultatio -- выслушивание) -- метод исследования внутренних органов, основанный на выслушивании звуковых явлений, связанных с их...
-
Математика представляет собой науку, расположенную как бы на границах естествознания. Вследствие этого ее иногда рассматривают в рамках концепций...
-
Общенаучные методы исследования - Методология научного исследования в естествознании
Процесс познания как основа любого научного исследования представляет собой сложный диалектический процесс постепенного воспроизведения в сознании...
-
Понятие "метод" (от греч. "методос" -- путь к чему-либо) означает совокупность приемов и операций практического и теоретического освоения...
-
Пальпация - Основные методы обследования больного при различных заболеваниях
Пальпация (от лат. palpatio -- ощупывание) -- клинический метод исследования при помощи осязания с целью изучения физических свойств и чувствительности...
-
Полиморфные белки - Методы исследования популяции человека
Изучая генетическую структуру населения определенного региона проводятся исследования генетико-биохимического полиморфизма систем транспортных белков...
-
"Обзорный" метод - Методы исследования популяции человека
Наиболее полноценным методом проведения популяционно-генетических исследований является "обзорный". Данный метод позволяет проводить обследование и...
-
Кора больших полушарий. Современные методы исследования функций мозга - Предмет и задачи физиологии
"Мозг - это последняя из тайн природы, Которая когда-либо откроется человеку." Англ. физиолог Чарлз Скотт Шеррингтон. "Асимметрия является основным...
-
Микроскопический метод исследования предусматривает наблюдение за живыми и убитыми микробами в окрашенном и неокрашенном состоянии. Различают простые и...
Методы выявления биопленок - Использование микробных биопленок в промышленности