Биотехнология Bacillus thuringiensis - Характеристика пестицидных белков Bacillus thuringiensis и их генетических детерминант

Биотехнологические проекты с использованием BT ведутся в двух основных направлениях: 1) использование различных штаммов ВТ в качестве источника генетических детерминант токсинов с целью создания новых трансгенных организмов, которые изначально не обладают способностью к синтезу пестицидных белков; 2) улучшение уже известных штаммов ВТ и родственных ей видов путем повышения биологической активности токсинов и расширения спектра действия пестицидных белков, синтезируемых конкретным штаммом, с целью последующего получения биопестицидных препаратов (Добрица и др., 2001; Federici et al., 2003; Walters et al., 2008).

В первом направлении большинство работ ведется в области создания трансгенных растений и бактерий (Schnepf et al., 1998). Трансгенные растения, способные экспрессировать Cry-гены, обладают высокой степенью устойчивости к своим специфическим вредителям, за исключением случаев приобретения последними устойчивости к токсинам. В качестве примера можно привести трансгенный сорт кукурузы MON863, устойчивый к Diabrotica spp. Он был получен путем введения в клетки зародыша растения ДНК-вектора, который содержал модифицированный Cry3Bb1 ген, встроенный под промотор 4-AS1, с которого идет синтез белка, усиливающего рост корней растения. Сам вектор со встроенным геном Cry3Bb1 был введен в клетки методом бомбардировки микрочастицами (Vaughn et al., 2005). Чужеродные гены могут быть введены в растительную клетку также с использованием векторов на основе вирусов растений и Ti-плазмид (Щелкунов, 2004).

Трансгенные бактерии используют в качестве биологического средства борьбы с различными вредителями сельского хозяйства и переносчиками определенных заболеваний. Например, сконструирован рекомбинантный штамм ВТ, несущий наряду с москитоцидными Cry - и Cyt-генами дополнительный ген, детерминирующий бинарный токсин, источником которого послужил геном Bacillus sphaericus. Этот трансгенный штамм обладает высокой инсектицидной активностью по отношению к представителям рода Culex (Federici et al., 2003). Путем конъюгационного переноса из клеток BT Cry-генов, продукты которых активны в отношении Чешуекрылых, в клетки Bacillus megaterium удалось также получить рекомбинантный штамм, продуцирующий инсектицидные белки. Поскольку использованный штамм B. megaterium в естественных условиях обитает на поверхности листьев хлопчатника, то обработка растений хлопчатника живой культурой клеток рекомбинантного штамма обусловила высокую степень устойчивости растений к поражению личинками Heliothis armigera: на протяжении 21 дня после обработки смертность личинок составляла 75-96% (Bora et al., 1994).

Что касается второго направления в биотехнологии ВТ, то оно подразумевает молекулярно-генетические манипуляции, генную и белковую инженерию, направленные на получение промышленных штаммов ВТ для производства биопестицидов и некоторых других препаратов. Так, значительное повышение инсектицидной активности штаммов ВТ может быть достигнуто путем создания рекомбинантных бактериальных клеток, Cry - и Cyt-гены которых происходят из различных штаммов. Таким образом добиваются расширения спектра действия препаратов, полученных на основе таких генно-инженерных штаммов (Добрица и др., 2001; Baum et al., 1996). В ряде случаев наблюдается синергетический эффект, когда один токсин усиливает действие другого или же оба токсина оказывают взаимоусиливающее влияние. В качестве примера можно привести Bacillus thuringiensis Subsp. Kurstaki, штамм IPM-46. В препаратах на основе этого рекомбинантного штамма Cry3A токсин проявляет значительно большую активность против колорадского жука, чем в исходном штамме, за счет усиления его активности токсином Cry1A. Полагают, что в этом случае Cry3A отвечает за связывание с рецепторами на мембране клеток кишечного эпителия колорадского жука, а Cry1A, обладая более высокой пороформирующей способностью по сравнению с Cry3A, образует собственно пору (Добрица и др., 2001). Интересно, что Cyt-токсины вследствие своего значительно более широкого спектра действия и высокой способности к порообразованию способны усиливать активность Cry-токсинов и расширять круг их видов-мишеней, функционируя, очевидно, как мембраносвязанный рецептор для самих Cry-токсинов (Manasherob et al., 2003; Perez et al., 2005). Таким образом, синергетический эффект основан на межмолекулярных взаимодействиях токсинов.

Недостатком непосредственного использования клеток ВТ после споруляции в качестве биопестицида или их споро-кристаллических комплексов является засорение окружающей среды спорами, поэтому часто для наработки токсинов в составе внутриклеточных кристаллических включений используют либо мутантные штаммы ВТ, неспособные к спорообразованию, либо штаммы других видов бактерий, например, представителей рода Pseudomonas. В последнем случае можно получить так называемые инкапсулированные биопестициды, в которых д-эндотоксины защищены от действия повреждающих факторов внешней среды клеточной оболочкой (Добрица и др., 2001).

Генно-инженерные манипуляции, направленные на определенные последовательности в составе генов, детерминирующих токсины, могут изменять свойства продукта этих генов. Например, путем сайт-специфического мутагенеза в последовательностях, кодирующих петли домена II, можно получить токсин, проявляющий специфичность уже по отношению к другому виду насекомых-вредителей (Liu, Dean, 2006), а путем изменения сайта распознавания для протеаз в домене I можно повысить активность токсина (Walters et al., 2008).

Похожие статьи




Биотехнология Bacillus thuringiensis - Характеристика пестицидных белков Bacillus thuringiensis и их генетических детерминант

Предыдущая | Следующая