СИНАПТОФИЗИН - Влияние холестаза на различные отделы мозга

Для изучения экспрессии синаптофизтина эксперименты проводились самцах крыс Wistar весом 200 ± 25 г. Все экспериментальные процедуры должны соответствовать Директиве Совета Европейского сообщества (86/609 / EEC) по уходу и использованию лабораторных животных. Это исследование было одобрено Комитетом по биомедицинской этике Гродненского государственного медицинского университета. Экспериментальных крыс анестезируют этиловым эфиром, а общий желчный проток лигируют на 3-5 мм ниже слияния лобарных протоков, применяя две лигатуры с последующим пересечением между ними. Животные контрольной группы подвергаются фиктивной операции. На 2-й, 5-й, 10-й, 20-й, 45-й и 90-й день животных из группы контроля и из группы с холестазом декапитировали, образцы их мозжечка собирали и фиксировали в цинк-этанол-формалине при 4 ° С (ночь), а затем залили в парафин.

Блоки парафина (7 мкм) разрезали LeicaRM2125 (микротомом RTS, Германия). Иммуногистохимическое обнаружение Syn проводили с использованием поликлонального первичного антитела кролика, Synaptophysin Antibody (PA5-27286, Thermo Scientific, США), разбавленного 1: 400 при 4 ° C, экспозиции в течение 20 часов во влажной камере. Связывание первичных антител было обнаружено с использованием Thermo Scientific Super Picture ™ Polymer Detection Kit. Глутаматдекарбоксилазу (GAD) детектировали с мышиными моноклональными первичными антителами против GAD 67, ab. 26116 (Abcam, UK), разбавленный 1: 2000 при 4 ° С, воздействие в течение 20 ч во влажной камере. Связывание первичных антител было обнаружено с использованием контейнера Expose Mouse и Rabbit Specific HRP / DAB IHC Kit ab. 80436 (Abcam, UK).

Для стандартизации исследования во всех образцах была исследована латеральная зона задней доли мозжечковых полушарий. Кора головного мозга этой области двусторонне связана с сенсомоторной корой головного мозга, что позволяет планировать и координировать быстрые движения тела, следующие один за другим. Определены уровни экспрессии Syn и GAD в структурах коры головного мозга. Гистохимические препараты были исследованы, сфотографированы и изучены морфометрически с использованием микроскопа Axioscop 2 plus (Zeiss, Германия) с цифровой видеокамерой LeicaDFC 320 (Leica, Германия) и программой анализа изображений ImageWarp (Bitflow, США)[15].

Средние значения, полученные у животных каждой экспериментальной группы, анализировались непараметрической статистикой (из-за небольшого числа животных в группах) в Statistica 10.0 для Windows (StatSoft, США). Описательная статистика для каждого параметра включала определение медианного (Me) и межквартильного диапазона (IQR). Различия между значениями в контрольной и экспериментальной группах считались значимыми при p <0,05 с использованием U-теста Манна-Уитни[16].

У контрольных животных экспрессия синаптофизина была обнаружена в многочисленных пресинаптических мембранах на дендритах клеток Пуркинье в молекулярном слое мозжечка, а также в аксональных синапсах и вокруг тел клеток Пуркинье. Экспрессия Syn была особенно высокой в гранулярных слоях клубочков мозжечка (рисунок 2.1 B, C). Интенсивность экспрессии синаптофизина у контрольных животных существенно не

экспрессия синаптофизина в коре мозжечка крыс[15]

Рисунок 2.1 - Экспрессия синаптофизина в коре мозжечка крыс[15]:

Рисунок 2.1 A, C-контроль (через 10 дней после фиктивных операций);

Рисунок 2.1 B, D - 10 дней холестаза.

B-в молекулярном слое (показанном стрелками) увеличение экспрессии синаптофизина; С-стрелки показывают гранулированные слоистые клубочки. Цифровая микрофотография. Масштабные бруски - 20 мкм. Увеличение: А, B-x200; C, D-x400.

Таблица 2.1 - Экспрессия синаптофизина в молекулярном слое коры мозжечка крыс (единица оптической плотности Ч 103[15])

День

Контрольная группа

Экспериментальная группа

2

187.03 ± 7.5

182.27 ± 12.7

5

182.77 ± 19.0

211.47 ± 5.62 ***

10

189.43 ± 15.4

261.18 ± 19.9 ***

20

187.54 ± 19.1

188.74 ± 17.6

45

186.77 ± 27.2

184.46 ± 5.6

90

180.0 ± 12.3

182.07 ± 14.0

На 2-й день после лигирования общего желчного протока в молекулярном слое коры мозжечка экспрессия синаптофизина не различалась, на 5-й день он увеличивался на 16%, а на 10-й день - на 38%, по сравнению с контрольной группой. На последующих временных интервалах исследования он не отличался от контрольной группы (рисунок 2.2 B, C, таблица 2.1)

Экспрессия глутаматдекарбоксилазы (GAD67) в цитоплазме клеток Пуркинье была обнаружена (как в телах, так и дендритах), а также вокруг тел клеток Пуркинье. В молекулярном слое также были видны глутаматдекарбоксилаза-иммуноположительные звездчатые и корзиночные клетки, образующие многочисленные аксональные и аксодендритные синапсы на клетках Пуркинье (рисунок 2.2 A, C). В гранулированном слое были обнаружены глутаматдекарбоксилаза-иммуноположительные нейроны, а также терминалы на периферии мозжечковых клубочков (рисунок 2.2 А, В).

На второй день после лигирования общего желчного протока в цитоплазме клеток Пуркинье экспрессия глутаматдекарбоксилазы уменьшилась на 10% (таблица 2.2). На 5-й день холестаза экспрессия глутаматдекарбоксилазы в цитоплазме остальных клеток Пуркинье увеличилась на 28%. Корзины вокруг перикариона стали более заметными, вытянутыми, удлиненными в направлении гранулированного слоя и проявляли более темное окрашивание из-за увеличения глутаматдекарбоксилазы-иммунореактивности на 11%. На 10-й день холестаза экспрессия глутаматдекарбоксилазы в цитоплазме выживших клеток Пуркинье увеличилась на 41% и в их корзинах на 39%, соответственно, по сравнению с контролем (рисунок 2.2 В, таблица 2.2). Холестаз в течение 20 дней приводил к увеличению экспрессии глутаматдекарбоксилазы в цитоплазме выживших клеток Пуркинье на 61% и увеличению их корзин на 33% по сравнению с контролем (рисунок 2.2 D, таблица 2.2). Однако на 45-й и 90-й день после лигирования общего желчного протока иммуногистохимические различия не определялись по сравнению с контрольными (таблица 2.2)[15].

экспрессия gad67 в коре мозжечка крыс[15]

Рисунок 2.2 - Экспрессия GAD67 в коре мозжечка крыс[15]:

Рисунок 2.2 А, С - контроль (10 дней и 20 дней после фиктивных операций, соответственно);

Рисунок 2.2 B - 10 дней;

Рисунок 2.2 D - 20 дней холестаза.

B, D-стрелки показывают увеличенные корзины с повышенной иммунореактивностью вокруг тел клеток Пуркинье. Цифровая микрофотография. Шкала шкалы -20 мкм Увеличение x400.

Таблица 2.2 - Экспрессия глутаматдекарбоксилазы в коре головного мозга крыс (единица оптической плотности Ч 103[15])

День

Тела клеток Пуркинье

Область вокруг клеток Пуркинье

Контроль

Экспериментальная группа

Контроль

Экспериментальная группа

1

2

3

4

5

2

182.12 ± 2.48

163.81 ± 4.85 **

197.27 ± 11.0

188.02 ± 14.42

5

160.54 ± 2.85

205.11 ± 5.37 ***

189.73 ± 16.09

211.18 ± 8.75 ***

10

166.37 ± 3.92

235.04 ± 4.27 ***

189.72 ± 12.88

264.26 ± 18,64 ***

20

155.51 ± 3.86

250.26 ± 3.88 ***

189.27 ± 10.12

251.16 ± 17.40 ***

45

166.37 ± 3.79

168.13 ± 4.44

188.22 ± 8.70

190.02 ± 14.29

90

166.36 ± 3.05

165.43 ± 4.13

189.73 ± 11.27

184.44 ± 16.81

Временное увеличение синаптофизина в молекулярном слое мозжечка может отражать усиленный синаптогенез, увеличение количества синаптических пузырьков в синапсах, что является компенсаторной реакцией.

Увеличение экспрессии глутаматдекарбоксилазы вокруг их тел указывает на активацию клеток ГАМК-эргической области, которые могут компенсировать гиперрезистентные клетки Пуркинье, возможно, для поддержки функций мозжечка[8].

Похожие статьи




СИНАПТОФИЗИН - Влияние холестаза на различные отделы мозга

Предыдущая | Следующая