Культивирование продуцента и биосинтез лизина в промышленных ферментерах - Этапы получения лизина

Проводят в стандартных биореакторах объемом 50, 63 и 100 м3. Такие аппараты должны обеспечить нормальный рост и развитие промышленного продуцента в асептических условиях; они снабжены необходимыми коммуникациями, теплообменниками, перемешивающими устройствами, штуцерами для подачи питательной среды и соответствующим оборудованием для ввода в нее стерильного воздуха, дополнительных питательных ингредиентов, растворов кислот и щелочей для поддержания pH среды на необходимом уровне, системами ввода стерильного пеногасителя и передачи культуральной жидкости на дальнейшую переработку. Перед началом культивирования ферментеры промывают и стерилизуют паром в течение 1 ч при 0,1 МПа.

Стерильная питательная среда в момент введения в биореактор имеет температуру, близкую к среде выращивания продуцента (32-35 °С), или около 80°С. В последнем случае для достижения температуры проведения процесса культивирования жидкую фазу охлаждают подачей холодной воды в рубашку аппарата или в теплообменники, расположенные внутри самого ферментера.

Состав питательной среды для различных штаммов-продуцентов может также различаться, как и при выращивании культуры в посевных аппаратах. Некоторые отличия могут наблюдаться в составах мелассных сред на стадиях получения продуцента в посевных аппаратах и основных ферментерах. Например, ранее указанному составу среды для посевного аппарата будет соответствовать соответствующее содержание основных компонентов питания для промышленных ферментеров (см. таблицу 1.4.3.1.).

Таблица 1.4.3.1. Среда для культивирования продуцента лизина в промышленном ферментере (в %)

Меласса (по содержанию сахара)

7-12

Кукурузный экстракт (по содержанию СВ)

1,2-1,5

Сульфат аммония

2

Калия фосфат: однозамещенный

0,05

двухзамещенный

0,05

Мел

1

Пеногаситель синтетический

0,1

Вода

Остальное

PH среды

7,0-7,2

Посевной материал в количестве 5-10% от объема питательной среды поступает в ферментер. Коэффициент заполнения последнего в зависимости от интенсивности пенообразования составляет 0,6-0,75. Процесс ферментации продолжается от 55 до 72 ч при интенсивном перемешивании и аэрации (0,8-1,0 объема воздуха на объем питательной среды в 1 минуту), повышенном давлении 0,02-0,03 МПа, постоянной температуре 28-32°С и контролируемом значении pH, которое в течение культивирования поддерживается на уровне 7,0-7,5; периодически производится подача стерильного пеногасителя.

В первые сутки культивирования продуценты ассимилируют около 25% углеводов и общего азота среды, в том числе почти все аминокислоты, в этот период образуется практически вся биомасса. Вторая стадия роста культуры сопровождается резким снижением скорости накопления биомассы и самыми высокими скоростями биосинтеза лизина -- 0,8-1,0 г/(л-ч). Питательная среда сильно истощается, возможно, значительное изменение pH раствора. На данном этапе осуществляют подтитровывание среды 25%-ным раствором аммиака. Последняя стадия культивирования может сопровождаться некоторой убылью биомассы за счет небольшого автолиза клеток и резким снижением скорости образования лизина.

Контроль за ходом процесса биосинтеза осуществляют на разных этапах его проведения по оптической плотности раствора культуральной жидкости (по содержанию клеток продуцента), по содержанию субстрата в смеси или по сигналам датчиков pH и растворенного кислорода в ферментационной среде. К концу процесса биосинтеза содержание лизина в культуральной жидкости достигает не менее 40 г/л, концентрация оставшегося субстрата не более 0,5-1,0%.

Количество накапливаемого лизина удается повысить, если по мере исчерпания источников углерода и азота в среду по ходу процесса дополнительно вводить небольшие количества этих питательных веществ. Организация дробной "подпитки", общий объем которой не превышает 10% объема исходной жидкой фазы, приводит к активизации биосинтетической деятельности микроорганизмов. На мелассной среде осуществление дробной "подпитки" позволяет увеличить концентрацию образующегося в культуральной жидкости лизина до 50 г/л. Экономический коэффициент по потреблению сахара в пересчете на лизин составляет 35%.

На ацетатной среде из-за токсичности субстрата биосинтез лизина возможен только при применении дробной подачи уксусной кислоты. Как и при получении посевного материала, содержание уксусной кислоты в жидкой фазе не должно превышать 2%. Введение в среду небольшого количества сахара, например глюкозы в количестве до 1,5%, способствует повышению выхода лизина на 30-50%. Экономический коэффициент по потреблению ацетата в пересчете на лизин достигает 27%. Использование такой среды позволяет снизить потребность продуцента в биотине до 1 мкг на 1 л среды, однако при этом предполагается соблюдение определенного соотношения дефицитных аминокислот (см. таблицу 1.4.3.2.).

Таблица 1.4.3.2. Среда для культивирования штамма Corynebacterium sp.

Ацетат аммония

1,5

Глюкоза

1,0

Калия фосфат однозамещенный

0,02

Сульфат магния

0,04

Сульфат аммония

3,0

Гидролизат соевой муки (по СВ)

1,5

Вода

Остальное

Соотношение треонина к метионину должно быть равно 3:1, содержание тиаминхлорида -- 0,04 мг/л, а биотина -- 0,05 мг/л. Уксусная кислота подавалась непрерывно в виде смеси 1 моль/л уксусной кислоты и 0,25 моль/л ацетата аммония с такой скоростью, чтобы концентрация ацетат-иона не превышала 1,5%.

К концу 72-го часа культивирования концентрация лизина составляет 34 г/л. Однако использование более высокопродуктивных штаммов-продуцентов и выбор оптимальных условий проведения процесса биосинтеза в реальном производстве позволяют за то же время культивирования достичь концентрации лизина 50 г/л.

Технология получения лизина, как и других аминокислот, одноступенчатым микробиологическим синтезом в зависимости от источника углерода предполагает использование специально подобранных штаммов-продуцентов. Количество субстрата, технология внесения его в среду, степень утилизации определяются физиологическими особенностями выбранного продуцента и адаптацией его к взятому источнику углерода.

Поскольку большинство промышленных продуцентов лизина обладает уреазной активностью, помимо традиционных источников азота в виде солей аммония возможно использование мочевины. Однако для каждого штамма выбор соли осуществляют экспериментально по наибольшему образованию лизина. На течение процесса биосинтеза оказывает влияние соотношение концентраций углерода и азота в среде, для каждого штамма существует свой оптимум. Например, для продуцента C. glutamicum 95 соотношение C:N=11:1, при его увеличении падает выход лизина, при уменьшении -- вместо лизина накапливается аланин. Недостаточная аэрация в ходе ферментации приводит к образованию молочной кислоты.

Для нормального роста и развития продуцента необходимо присутствие в среде фосфора. Его включают в состав питательных сред в виде калиевых солей фосфорной кислоты. Однако количество фосфора в среде регламентировано в пределах 8-20 мг %. Увеличение данной концентрации на один порядок для продуцента C. glutamicum почти наполовину снижает выход лизина.

Все продуценты лизина в той или иной степени испытывают потребность в ряде макро - и микроэлементов: магнии, железе, меди, марганце. Эти металлы вводят в среду в виде солей серной кислоты; сульфат магния задают на уровне 0,03--0,05%, остальных солей берут меньше -- от 0,0008 до 0,001%. Железо, медь и марганец специально в среды не вносят, если они присутствуют в достаточном количестве в пшеничном экстракте, мелассе и других компонентах среды.

Выход лизина тесно связан с основными параметрами процесса ферментации: температурой, концентрацией растворенного кислорода, длительностью культивирования, дозой и возрастом посевного материала.

Для продуцентов лизина температурный оптимум роста, развития и биосинтеза аминокислоты 28 - 30°С. Повышение температуры культивирования на 5°С приводит к быстрому автолизу клеток, и в среде накапливается значительно меньше лизина. Снижение температуры на 5° от оптимальной, хотя и не снижает выхода лизина, однако отрицательно сказывается на экономике процесса биосинтеза, поскольку время культивирования удлиняется в среднем на 12 - 20 часов. pH среды культивирования бактериальных штаммов-продуцентов 6 - 8,5. Для промышленных штаммов, используемых в настоящее время, оптимум значения pH 7,0 - 7,5.

Различные продуценты лизина испытывают неодинаковую потребность в кислороде, но поскольку процесс биосинтеза предполагает высокую активность дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот и ферментов глиоксалатного цикла, производственное культивирование должно проводиться при интенсивной аэрации. Количество растворенного в жидкой фазе кислорода необходимо поддерживать на оптимальном уровне. Недостаточная аэрация приводит к образованию аланина и молочной кислоты за счет снижения выхода лизина. Слишком интенсивная аэрация способствует усиленному росту биомассы, выход лизина при этом также начинает снижаться. В процессе культивирования концентрацию растворенного кислорода контролируют по его парциальному давлению (рО2). В момент наибольшей скорости образования биомассы и начала активного биосинтеза лизина (в период от 16 до 20 ч роста культуры) величина (рО2) резко снижается, что может отрицательно сказаться на биосинтезе аминокислоты. Показано, что в момент критического снижения парциального давления в ферментер требуется подать такое количество воздуха, чтобы концентрация растворенного кислорода не оказалась ниже 20-30% значения, соответствующего насыщению культуральной жидкости в данных условиях.

Количество подаваемого на производственную ферментацию посевного материала обычно колеблется в пределах 1-5%, с повышением дозы посевного материала выше экономический коэффициент, короче лаг-фаза и меньше время получения производственной культуры. Поскольку скорость роста клеток и максимум скорости биосинтеза лизина между собой не совпадают, практически вся биомасса образуется в первые 12-18 ч, а лизин начинает синтезироваться в заметных количествах лишь тогда, когда рост биомассы замедляется. С началом образования лизина связано уменьшение в размере клеток продуцента. Наиболее характерным признаком начала биосинтеза лизина является почти полное потребление из среды дефицитных для ауксотрофного мутанта аминокислот, например треонина. Эти факторы могут учитываться при организации микробиологического и биохимического контроля процесса ферментации.

Готовая культуральная жидкость помимо лизина и других продуктов метаболизма содержит биомассу продуцента и остатки непотребленных питательных веществ среды. В зависимости от конкретных целей производства на основе культуральной жидкости можно получить технические препараты в виде жидкого концентрата лизина (ЖКЛ) и сухого кормового концентрата лизина (ККЛ), а также высококонцентрированные кормовые и высокоочищенные кристаллические препараты для пищевой и медицинской промышленности. Производство каждого из этих препаратов осуществляется по своей технологии.

Поскольку практически весь L-лизин, производимый в мире микробиологическим синтезом, расходуется на обогащение кормов сельскохозяйственных животных и птицы, основное внимание далее будет уделено рассмотрению технологических особенностей получения кормовых препаратов.

Ранее в СССР широкое распространение имели кормовые препараты лизина в виде ЖКЛ и ККЛ. Технико-экономические показатели производства таковы, что существующая технология позволяет получать ценные кормовые добавки по приемлемой для сельского хозяйства стоимости. Его отличительной особенностью является получение технических препаратов лизина на основе всей суммы веществ, присутствующих в культуральной жидкости, включая биомассу продуцента и твердые нерастворимые частицы исходной среды. Помимо лизина товарные формы ЖКЛ и ПКЛ содержат большое количество других соединений, повышающих ценность кормовой добавки, например витамины Bi, В2, В3, В4, РР и др.

Похожие статьи




Культивирование продуцента и биосинтез лизина в промышленных ферментерах - Этапы получения лизина

Предыдущая | Следующая