Производство лимонной кислоты методом ферментации - Бродильное производство органических кислот

Производство лимонной кислоты методом ферментации при участии грибов также принадлежит к числу давних биотехнологических процессов; оно было налажено в 1893 г. Его развитие шло в тесной связи с разработкой многих фундаментальных аспектов микробиологии. Вначале основные проб-лемы были связаны с микробным загрязнением. В поисках их решения было найдено, что процесс можно вести при очень низких рН, и это почти не сказывается на образовании кислоты грибами. В таких условиях создавать и поддерживать стерильность гораздо проще. За 1 -- 2 недели ферментации при высоких концентрациях сахара в сырье выход достигал 60%. Наиболь-ший выход получали, когда тем или иным способом ограничивали рост мицелия[8]. Первоначальный вариант процесса основывался на поверхностной ферментации, но в 1950 г. было внесено важное изменение -- освоено глубинное культивирование. Было показано, что стабильный процесс глубинной ферментации воз-можен только в том случае, если он осуществляется в две стадии: на первой идет рост мицелия, а на второй (в несодержащей фосфор среде) -- образование лимонной кислоты. За короткий срок были разработаны схемы, основанные на использовании дешевого углеводного сырья: мелассы, крахмала и глюкозного сиропа. Наличие ионов металлов в исходном сырье приводит к резкому падению выхода; их нужно удалять либо путем осаждения гексацианоферратом, либо пропусканием через ионообменные смолы, либо применением солей четвертичного аммония[5]. Для устранения вредного влияния этих примесей широко используется также метанол и другие низшие спирты. Механизм их действия неизвестен.

Возможно, они как-то влияют на цитоплазматическую мембрану[4]. В 60-х годах для производства лимонной кислоты был предложен новый процесс на основе н-парафинов (СЭ-3О) и штаммов Corynebacterium, Arthrobacter и Brevibacterium, но рыночной продукции с его помощью получено не было. Изучалось также образование лимонной кислоты дрожжами Candida. Они синтезируют смесь лимонной и изолимонной кислот в соотношении, зависящем как от генетических факторов, так и от условий ферментации. Было найдено, что ключевую роль здесь играет аконитат-гидролаза: мутанты с малой активностью этого фермента продуцировали больше лимонной кислоты. Растущие на углеводородах дрожжи также способны синтезировать лимонную кислоту из глюкозы. Гриб Trichoderma vlride образует большое количество цитрата из глюкозы; это позволяет вырабатывать лимонную кислоту из целлюлозы. С помощью некоторых видов Penicillium можно вести ферментацию с образованием Ls-алло-изолимонной кислоты, диастереомера изолимонной кислоты[8].

В промышленном производстве лимонной кислоты в основном используется Aspergillus niger, но применяется также и А. wentii. Процесс ферментации очень сложен, так как лимонная кислота является продуктом первичного метаболизма этих грибов, и любое сколько-нибудь существенное выделение этого промежуточного соединения обмена веществ в окружающую среду свидетельствует о сильном нарушении метаболизма, воз-никающем вследствие его дисбаланса или генетических нарушений. Рост грибов обычно регулируют путем изменения состава среды (Р, Mn, Fe, Zn)[1]. Субстрат должен легко усваиваться; негидролизованные полимеры обычно не используют, так как в этом случае внеклеточный гидролиз будет лимитировать скорость всего процесса.

Сверхпродукция лимонной кислоты является ответной реакцией на недостаток фосфата, но при выраженной нехватке металлов лимитирующим фактором не обязательно является фосфат. Роль металлов при этом до конца еще не понята. Оптимум рН составляет 1,7--2,0; в более щелочной среде происходит образование заметных количеств щавелевой и глюконовой кислот. Таким образом, тщательный контроль за культуральной средой позволяет обойти регуляторные системы обмена и создает оптимальный фон для образования лимонной кислоты. Видимо, в этих условиях стимулируется гликолиз и обеспечивается неограниченное поступление углерода в реакции промежуточного метаболизма. Уровень накопления цитрата зависит при этом от поступления оксалоацетата[7].

При недостатке марганца активность ферментов цикла трикарбоновых кислот уменьшается, что в свою очередь подавляет анаболизм. Такое нарушение обмена приводит к повышению концентрации аммонийных ионов внутри клеток, и они могут смягчать ингибирующее влияние цитрата на фосфофруктокиназу. Кроме того, марганец, видимо, как-то влияет на биохимические свойства поверхности клеток и морфологию гиф. Поскольку в процессе потребляется много кислорода, возможно повторное окисление цитоплазм этического NADH без образования АТР. В нем участвует альтернативная, а не основная цепь дыхательных реакций. В результате без сколько-нибудь выраженного изменения обмена возникает метаболическая "утечка" (Них) через гликолиз. Эта утечка, происходящая при участии конститутивной пируваткарбоксилазы и некоторых ферментов цикла трикарбоновых кислот, а также необычная кинетика действия ферментов, участвующих в метаболизме оксалоацетата, приводят к увеличению внутриклеточной концентрации цитрата[5]. Последний способствует дальнейшему накоплению цитрата путем ингибирования изоцитратдегидрогеназы.

В промышленном производстве лимонной кислоты применяется несколько вариантов процесса. Традиционным твердофазным вариантом является процесс Коджи; он имеет много общего с процессом поверхностной ферментации. Глубинная ферментация с технической точки зрения сложнее, чем поверхностная, но возможна в разных вариантах: периодическом с подпиткой и непрерывном[1]. Периодическая ферментация используется при работе с глюкозосодержащими субстратами, а ее вариант с подпиткой чаще применяется при переработке мелассы. Непрерывное культивирование, дающее наибольший выход продукта, также возможно, но применение этого способа в промышленности в обозримом будущем маловероятно. Для процесса характерно два максимума скорости: роста и образования продукта. На первом этапе образуется значительное количество продукта, зависящее от скорости роста. На втором этапе рост отсутствует, а предельное количество образующегося продукта определяется концентрацией биомассы. В конце ферментации массу мицелия отделяют фильтрованием и промывают. Затем при рН<3,0 осаждают щавелевую кислоту в форме оксалата кальция. Богатый белком мицелий можно использовать на корм скоту. Лимонную кислоту осаждают из жидкой фазы в форме кальциевой трехзамещенной соли в комплексе с четырьмя молекулами воды. Осадок отфильтровывают, промывают и свободную кислоту получают путем обработки сульфатом кальция[5]. Далее ее очищают при помощи активированного угля и ионообменных смол. Можно также экстрагировать кислоту растворителем.

У лимонной кислоты приятный кислый вкус, она хорошо растворима в воде. Ее широко используют в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности. Эфиры лимонной кислоты применяются в производстве пластмасс. Поскольку лимонная кислота связывает (хелатирует) металлы, ее используют для их очистки[4]. В составе детергентов она легко разруша-ется живыми организмами, и ею заменяют фосфаты.

Похожие статьи




Производство лимонной кислоты методом ферментации - Бродильное производство органических кислот

Предыдущая | Следующая