Как увидеть память - Технологии изучения клеточных механизмов памяти

Итак, экспрессия многих генов зависит от нейронной активности, соответственно, этот феномен получил название активностно-зависимой генной экспрессии. А само его существование означает, что в исследовании памяти можно достичь клеточного разрешения. Нейроны, хранящие память, можно "проявить", то есть провести нейроимиджинг. Для этого сначала нужно создать у экспериментального объекта воспоминание, с которым, собственно, мы будем работать. Классическим объектом является лабораторная мышь. Животное "по просьбе" исследователей приобретает какой-либо опыт: воспринимает, например, незнакомую обстановку, звук или запах. В это время в его мозге активируется некая популяция нейронов. Однако, чтобы этот опыт отложился в памяти, он должен быть достаточно значимым для мыши (ведь и мы запоминаем далеко не все, что с нами происходит). Надежней всего придать ему значение опасности, и классический способ это сделать -- в ходе эпизода опыта ударить мышь слабым электрическим током. И вуаля -- активировавшаяся популяция нейронов гарантированно сохраняет информацию о новых обстановке, звуке или запахе. Эта популяция будет субстратом для имиджинга.

Используем то, что есть

Иммуногистохимический метод имиджинга основан на заповедной иммунореакции антиген--антитело. Срезы мозга животного, убитого вскоре после приобретения памяти, обрабатываем сывороткой, содержащей антитела. В качестве антигена, который они свяжут, выступает белок -- продукт экспрессии немедленного раннего гена. Антитело конъюгировано (соединено) с меткой (флуоресцентной либо с ферментом, после пары манипуляций тоже дающим цветную реакцию), которую будем регистрировать с помощью микроскопа (рис. 1). Между белком-антигеном и меченым антителом обычно "встраивают" несколько видов промежуточных антител -- для усиления чувствительности [13], -- впрочем, сущности метода это не меняет.

Другой метод основан на выявлении мРНК немедленных ранних генов. Конструируются специальные молекулярные зонды, которые при нанесении на исследуемый образец мозга соединяются с мРНК по принципу комплементарности, но кроме того несут собственно метку, по которой мы мРНК обнаружим. Метка может быть флуоресцентной или требовать дополнительной процедуры окрашивания. Описанный метод называетсяFISH (fluorescence in situ hybridization).

Рисунок 1. Иммуногистохимическое выявление белка Arc в зубчатой извилине крысы. Рисунок из "Википедии"

Он, однако, был доработан специально для целей нейробиологии и приспособлен под выявление в одном образце мозга двух популяций нейронов, активированных двумя различными эпизодами опыта, произошедшими с разницей в небольшой промежуток времени (около 30 минут). Такую модификацию метода назвали cellular compartment analysis of temporal activity by FISH, или простоcatFISH [14]. Сигнал от двух популяций реально идентифицировать благодаря тому, что немедленные ранние гены характеризуются очень мощной экспрессией в момент активации при почти полном фоновом (вне эпизодов нового опыта) "молчании" [3].

Такие метки представляют собой флуоресцентные белки. Об их многообразии и применении в биологических исследованиях рассказывают статьи: "Флуоресцирующая Нобелевская премия по химии" [15], "Флуоресцентные белки: разнообразнее, чем вы думали!" [16], "Флуоресцентные репортеры и их молекулярные репортажи" [17]. -- Ред.

Собственно имиджинг сводится к выявлению в образце двух форм мРНК: ядерной (незрелой), начинающей накапливаться в нейронах через две минуты после активации, и цитоплазматической (зрелой), образующейся из ядерной через 30 минут после активации. Таким образом, по цитоплазматической мРНК мы определяем популяцию клеток, активированную первым эпизодом опыта, а по ядерной -- вторым. Поскольку бомльшая часть ядерной мРНК исчезает, переходя в зрелую цитоплазматическую форму в течение 20 минут после активации клетки, ее сохранение со времен первого эпизода незначительно; ядерная мРНК от второго эпизода и вовсе не успевает перейти в цитоплазматическую форму [14].

В классической методике форму мРНК (ядерная она или цитоплазматическая?) определяют с помощью прямой оценки пространственной локализации (рис. 2), но уже практикуется использование двух зондов, каждый из которых специфичен к одной из форм мРНК и конъюгирован с уникальной меткой. После окрашивания метки дают разный цвет, по которому становится понятна локализация [18, 19].

Рисунок 2. Прямая оценка пространственной локализации Arc-мРНК в методе catFISH. Слева -- После активации нейронов Arc-мРНК локализуется в ядре. Справа -- Через 30 минут мРНК перемещается за пределы ядра. Рисунок из [42].

Доделываем то, что нужно

Ст?ит пояснить, что кроме кодирующего участка (экзона) ген имеет и регуляторные, среди которых особенно важен промотор -- участок, ответственный за запуск считывания гена (транскрипции). В случае отсутствия промотора транскрипция не запустится, а вот без "родного" экзона (например, если мы его вырежем и вставим другой) транскрипция будет возможна, причем синтезироваться будет, понятно, продукт, кодируемый вставленным нами экзоном. Эту возможность и используют биологи, подставляя под промоторы немедленных ранних генов то, что им выгодно.

Они получают мышь, несущую в ДНК трансген, в котором под промотором немедленного раннего гена находится экзон тетрациклинового активатора транскрипции, tTA (рис. 3). Продукт экспрессии этого трансгена -- белок tTA -- связывается с тетрациклин-откликающимся элементом (tetO) в составе второго трансгена, имеющегося у мыши, тем самым активируя его транскрипцию [20]. Продукты экспрессии второго трансгена -- это специально разработанная для целей нейробиологии форма фермента в-галактозидазы (tau-LacZ), выступающая в качестве метки [21], а также автономная форма тетрациклинового активатора транскрипции (tTA*). Антибиотик доксициклин (производное тетрациклина) связывает белок tTA и блокирует его активирующее действие на второй трансген.

Устранение же доксициклина приводит к активации трансгена и к синтезу tau-LacZ и tTA*, причем tTA* имеет положительную обратную связь, порождающую перманентное производство tau-LacZ и tTA* даже после возвращения доксициклина в систему. Такие трансгенные мыши всю жизнь держатся на доксициклиновой диете, а во время эксперимента антибиотик отменяется, что позволяет нарабатываться метке [20].

Получается, что именно метка в конечном счете находится под контролем промотора немедленного раннего гена, а вспомогательная система tTA-tetO делает возможным мечение не всех клеток, в которых на протяжении жизни животного сработали немедленные ранние гены, а только тех, в которых они сработали во время нашего эксперимента (то есть сохранивших память о конкретном эпизоде опыта). Проявляется метка посредством цветной ферментативной реакции со своим специфическим субстратом, которым мы обрабатываем образцы мозга. Подобно catFISH, мы можем использовать методику и для выявления двух популяций нейронов, активированных различными эпизодами опыта. Но поскольку метка сохраняется в клетках длительно (из-за автономной активности tTA*), велика верхняя граница времени, на которое могут быть разнесены эпизоды, тогда как в случае catFISH это время может лишь немного отличаться от 30 минут

Рисунок 3. Использование трансактивационной системы tTA-tetO для активностно-зависимого мечения нейронов. а -- tTA синтезируется избирательно в нейронах, в которых активировался промотор c-fos. Однако доксициклин связывает tTA и предотвращает его взаимодействие с tetO. б -- После отмены доксициклина tTA от него освобождается и связывается с tetO, индуцируя синтез tau-LacZ и tTA*. в -- После возвращения доксициклина tTA снова инактивируется, но так как tTA* все еще присутствует, он по принципу положительной обратной связи поддерживает активность tetO. Рисунок из [42].

Важно здесь другое: второй эпизод должен произойти непосредственно перед убоем, так как относящуюся к нему популяцию нейронов мы будем выявлять по иммунологическим реакциям с белком немедленных ранних генов*, который, как мы помним, сохраняется кратковременно. Описанная методика двойного выявления носит названиеTetTag (рис. 4).

выявление двух популяций нейронов в гиппокампе мыши с помощью методики tettag.зеленым окрашен tau-lacz, красным -- белок немедленных ранних генов (слева -- c-fos, справа -- zif268).рисунок из [43]

Рисунок 4. Выявление двух популяций нейронов в гиппокампе мыши с помощью методики TetTag. Зеленым окрашен tau-LacZ, красным -- белок немедленных ранних генов (слева -- c-fos, справа -- Zif268).Рисунок из [43].

Давайте теперь посмотрим на другую мышь. У нее есть трансген, в котором под промотором немедленного раннего гена находится экзон тамоксифен-зависимой рекомбиназы Cre (CreERT2), и есть другой трансген, состоящий из синтетического промотора (CAG), экзона красного флуоресцентного белка (tdTomato) и разделяющей их стоп-последовательности, ограниченной с обеих сторон короткими loxP-участками. Активация первого трансгена приводит к синтезу Cre-рекомбиназы. В отсутствие лекарственного вещества тамоксифена этот фермент плавает в цитоплазме, в то время как взаимодействие с тамоксифеном позволяет ему проникать в ядро и производить рекомбинацию. Под рекомбинацией здесь понимается процесс, в ходе которого этот фермент распознает loxP-сайты и вырезает (удаляет) ограниченный ими участок (стоп-последовательность), "разрешая" экспрессию стоящего далее экзона (tdTomato) [22, 23]. Таким образом, если во время эксперимента сделать мыши инъекцию тамоксифена, можно запустить наработку красного флуоресцентного белка, опосредованную активацией немедленного раннего гена. Нейроны, вовлекшиеся в сохранение воспоминания, будут флуоресцировать под действием посылаемого в них микроскопом лазерного луча (рис. 5).

Рисунок 5. Использование рекомбинационной системы Cre/loxP для активностно-зависимого мечения нейронов. Вверху -- Рекомбиназа Cre, произведенная в нейронах с активировавшимся промотором IEG (immediate early gene), без тамоксифена не может попасть в ядро клетки, так что рекомбинации не происходит. Внизу -- Введение тамоксифена вызывает рекомбинацию в активных клетках (тогда как неактивные остаются нетронутыми, потому что и вовсе не экспрессируют ген Cre-рекомбиназы). Запускается наработка красного флуоресцентного белка. Рисунок из [22].

Между прочим, посмотреть выявленную нейронную сеть можно прямо на живом животном! Для этого можно зафиксировать его голову под объективом, а можно использовать специальные регистрирующие модули, закрепляемые на голове свободноподвижных животных и соединяющиеся с массивными элементами микроскопа через оптоволокно (рис. 6). Такие технологии позволяют проводить достаточно длительный мониторинг интенсивности флуоресценции клеток (то есть накопления белка, участвующего в формировании памяти). Флуоресцентная метка сохраняется в клетке если не навсегда, то по крайней мере неопределенно долго, а значит, мы снова можем выявлять популяции нейронов, активированные двумя значительно разнесенными эпизодами опыта. При этом верхняя граница времени их разнесения неопределенно велика, нижняя же зависит от времени наработки метки (для красного флуоресцентного белка примерно три дня)

Рисунок 6. Технологии для нейробиологических исследований на живых животных. а -- Стационарный микроскоп. б -- Волоконно-оптический нейроинтерфейс. в -- Мышь со вживленным модулем нейроинтерфейса. г -- Мышь с присоединенной световодной частью. Рисунок из [24].

Сама процедура имплантации регистрирующего модуля в мозг мыши незамысловата. В черепе проделывают дырку диаметром около 1 мм и вводят через нее модуль, закрепляя его цианоакрилатным клеем типа "Момента" (без шуток) и стоматологическим цементом. Оптоволоконный зонд присоединяется к модулю только на время снятия данных, не стесняя жизнедеятельность мышей в остальное время. Такая технология позволяет собирать флуоресцентный сигнал, идущий из глубины в несколько миллиметров, с площади в доли квадратного миллиметра [24, 25], чего вполне достаточно для получения представления о пространственной структуре нейронной сети, учитывая, что большинство нейронов не превосходят в диаметре нескольких десятков микрометров. После имплантации модуля мыши чувствуют себя вполне комфортно и достоверно не отличаются по поведению от мышей, не подвергавшихся процедуре. Модуль долгое время никуда не смещается, позволяя наблюдать за активностью одной и той же группы нейронов в течение нескольких недель [24, 25].

Описанная методика двойного выявления с использованием флуоресцентного белка называется TRAP (targeted recombination in active population). У TRAP есть преимущества перед TetTag, появляющиеся из-за различного характера зависимости систем tTA-tetO и Cre/loxP от фармпрепаратов. Прекращением подачи доксициклина или введением тамоксифена мы активируем систему на определенный отрезок времени. Все нейроны, проявившие активность в пределах этого времени, будут перманентно помечены.

Для системы TetTag чувствительное временн?е окно велико: максимальная экспрессия метки развивается лишь через две недели после прекращения введения доксициклина [22]. Это неудобно и требует дополнительных усилий, чтобы по возможности предотвратить мечение нейронов, активность которых попала в чувствительное временное окно, но не относилась к самому эксперименту.

Для системы TRAP "махинации" с фармпрепаратом позволяют делать окна шириной приблизительно 10 либо 40 часов [22]. В обоих случаях это значительно меньше, чем для системы TetTag, но в то же время достаточно для экспериментов, в которых может требоваться интеграция активности нейронов на протяжении какого-то промежутка времени (рис. 7).

Зачем вообще нужно выявлять две популяции нейронов в одном образце мозга?

Например, мы можем изучать, что происходит с памятью при воспроизведении.

Рисунок 7. Выявление двух популяций нейронов, отвечающих на различные звуковые частоты, в таламусе мыши с помощью методики TRAP. По горизонтали -- различные комбинации звуковых частот. Лиловый цвет представляет собой флуоресценцию трансгенного маркерного белка (tdTomato), зеленым окрашен белок немедленного раннего гена с-fos. Рисунок из [22].

Если в эксперименте в качестве второго эпизода опыта провести напоминание, имиджинг как раз покажет, как изменился вид активирующейся нейронной сети. Знания о том, что происходит с памятью при воспроизведении, предоставляет возможности эффективного вмешательства в нее на этой стадии [26]. Например, возможность ослабления травмирующих воспоминаний. У животных эти воспоминания получается стереть напрочь, вводя на стадии воспроизведения ингибиторы синтеза белка [5], хотя подвергнуть такому человека было бы как-то дико (рис. 8).

Не менее важные результаты приносит выявление в одном образце мозга популяций нейронов, хранящих различные воспоминания. Их перекрытие на поведенческим уровне проявляется формированием у животного ассоциативной связи, то есть мы можем изучать молекулярные механизмы обучения.

Рисунок 8. Кадр из фильма "Вечное сияние чистого разума". Рисунок взят с сайтаhttps://www. pinterest. com.

Как увидеть память - Технологии изучения клеточных механизмов памяти

Похожие статьи