Введение - Диагностические оценки ПЦР и РПИФ при использовании выборки от полевых вспышек африканской чумы свиней
Основной особенностью семилетнего развития эпизоотического процесса АЧС в сильно структурированном свиноводстве Российской Федерации является наблюдаемая периодичность его активных фаз (эпизоотий) с короткими межэпизоотическими периодами с низкой или очень низкой месячной инцидентностью вспышек (спорадические случаи) как в стадах домашних свиней, так и популяциях диких кабанов. Инфекция АЧС всегда сопровождалась геморрагическим воспалением, коротким инфекционным периодом (5-7 дней) с последующим фатальным 100% исходом [1], что свидетельствует о высокой вирулентности вируса [1, 8, 9].
Сразу же, после интродукции вируса АЧС на территорию РФ, для подтверждения инфекции использовали лабораторные методы по ГОСТ 2857-90 "Свиньи. Методы лабораторной диагностики африканской чумы свиней" [3, 10]. Рекомендованные методы предназначались для диагностических исследований АЧС при острой (изоляция вируса с использованием культуры макрофагов in vitro и феномена гемадсорбции, реакция прямой иммунофлуоресценции, сэндвич ИФА), хронической и латентной формах течения (реакция непрямой иммунофлуоресценции, непрямой иммуноферментный анализ). Ранее, хорошая диагностическая эффективность этих реакций была признана экспертами МЭБ при ликвидации АЧС в Европе и Латинской Америке в 20 веке [13, 15]. Исторически, в РФ для указанных методов реагенты и наборы препаратов были разработаны еще в 70-80 годы прошлого столетия [2, 7], но имели статус валидированных только на основании использования выборки от экспериментальной инфекции АЧС. Первая публикация относительно ПЦР, как диагностического метода, была в 1992 году [14], а в РФ - в 1995 году [11]. Позднее, после усовершенствований, в практику диагностики АЧС была введена ПЦР в реальном времени [12], но вопросы валидации ПЦР (варианты электрофорезного и в реальном времени) практически были освещены очень ограниченно [4, 5, 6].
В связи с перманентным развитием эпизоотической ситуации, основной интерес властей к лабораторным исследованиям был основан, прежде всего, на необходимости быстрого подтверждения подозрения на АЧС. Благодаря активному влиянию госветслужбы, были организованы централизованные государственные закупки диагностических средств и оборудования, тренинг практических ветеринарных специалистов в научно-исследовательских учреждениях страны, поэтому ПЦР, РПИФ и ИФА были очень быстро внедрены в обычную практику ветеринарных лабораторий [9, 10]. С точки зрения объектов обнаружения, рассматриваемые реакции можно считать условно зависимыми (обе реакции обнаруживают вирус) и независимыми, так как на молекулярном уровне ПЦР обнаруживает фрагменты вирусспецифической ДНК, а РПИФ (или ИФА) - вирусспецифические полипептиды. Однако, хорошие научные знания принципа работы реакций и их блестящее техническое выполнение, могут объяснить только механизмы обнаружения компонентов вируса и представлять только свидетельства их обнаружения (то есть продукты амплификации или люминесцентная визуализация вирусных белков). Однако, для достижения основной цели лабораторных исследований - непредубежденно оценивать полученные результаты реакций и затем делать заключение "болезнь есть" или "болезни нет", требуются очень хорошо выверенные знания диагностических характеристик используемых методов. Поэтому, из-за отсутствия таких данных ветеринарным руководством было принято решение об обязательной перепроверке положительных результатов ПЦР и РПИФ (но не отрицательных), полученных практическими ветеринарными лабораториями на АЧС, в научных учреждениях (ВНИИВВиМ или ВНИИЗЖ).
Таким образом, имея в своем распоряжении данные масштабных лабораторных скринингов большого количества инфицированных АЧС и интактных домашних свиней и кабанов, выполненные ВНИ-ИВВиМ и практическими ветеринарными лабораториями в течение 2008-2013 годов, а также все выборки при вспышках, основной целью исследований было валидация ПЦР и РПИФ и оптимизация схемы выполнения для усиления законности лабораторных исследований на
АЧС.
Материалы и методы. Для выполнения РПИФ и ПЦР использовали коммерческие серии наборов и реагентов собственного производства:
- - "Специфические ФИТЦ-иммуноглобулины АЧС для им-мунофлуоресцентной диагностики африканской чумы свиней" - коммерческие серии ВНИИВВиМ; выполнение РПИФ в соответствии "Инструкции по применению"; - "Тест-система для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени" - коммерческие серии ВНИИВВиМ.
В практических ветеринарных лабораториях была использована также коммерческая тест-система "АЧС" для выявления генетического материала вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (производство ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии).
Учет результатов реакций был дихотомический (то есть "положительный" или "отрицательный"), несмотря на субъективные оценки по 4-х бальной шкале для РПИФ или инструментальные по Ct - оценкам для ПЦР.
Для индивидуальной оценки диагностических характеристик ПЦР и РПИФ использовали сложную выборку, которая включала полевые экспертизы, сгруппированные в страты, включавших пробы от всех павших домашних свиней или диких кабанов, классифицированные как "референс-положительные АЧС" (на основании опроса и идентифицированные как ПЦР-положительные и/или РПИФ-положительные практическими ветеринарными лабораториями). Так как типы проб были разными (для ПЦР использовали пробы крови/сыворотки, костного мозга, а для РПИФ - в основном, только селезенки), количества выборок для оценки каждой реакции также были разными.
Выборки "неинфицированных" домашних свиней и диких кабанов были из исторически свободных по АЧС территорий РФ.
Такой тип выборки для парных лабораторных исследований был использован для оценки различий диагностической чувствительности и согласованности реакций. Для этого выборки (п. 1.2.1.) были "нормализованы" по размеру и типу пробы, то есть для оценок реакций от каждого животного выборки отбирали парную пробу селезенки.
Кроме выборки павших животных, в исследованиях сравнений реакций также использовали парные пробы селезенок случайной выборки отстрелянных диких кабанов в неблагополучных по АЧС субъектах РФ.
Так как данный проект выборки предназначен для сравнения, размер и структура выборки были для каждой реакции одинаковыми.
При непарных лабораторных исследованиях было последовательное выполнение каждой реакции индивидуально, когда не все пробы могли быть проверены каждой реакцией. Данный проект был предназначен для определения индивидуальных диагностических характеристик ПЦР и РПИФ.
При парных лабораторных исследованиях - параллельное выполнение реакций, то есть тестирование одних и тех же проб ПЦР и РПИФ было предназначено для оценок различий чувствительности и согласованности реакций.
Использовали статистические методы определения величины диагностической чувствительности, диагностической специфичности с использованием таблицы 2*2 [11], различий (МсМетаг'в-статистика) и согласованности (каппа) реакций с использованием пакета программ WinEpiscope 2.0 и Medcalc 10. Для определения прогностических положительных и отрицательных результатов реакций (прогностических характеристик) и эффективности параллельного выполнения использовали данные превалентности АЧС в разных фермах домашних свиней [1] и программу "MultipleDiagnosticTest" пакета WinEpiscope 2.0.
Проект и процесс выборки, осуществляемые на основе использования полевых проб для валидации методов, очень трудны, поэтому требуют описания деталей и пояснения, чтобы дальнейшие интерпретации данных и выводы авторов были понятными. От корректности выборки зависит точность диагностических показателей и рекомендаций относительно стратегии применения лабораторных методов. В наших исследованиях выборки были выполнены практическими ветеринарными врачами при вспышках АЧС в период с 2008 по 2013 годы включительно в 30 субъектах Российской Федерации. Процедуры выборки чаще были от первично инфицированных АЧС павших свиней (целенаправленная выборка), но всегда имели элемент случайности, а также неконтролируемые вмешивающиеся факторы. Поэтому границы терминологии выборки междуэмпирической и случайной установить трудно и потребовалось немало усилий для селекции и приведения проб их в приемлемый статистический порядок. В таблице 1 приведены наиболее общие данные количеств обследованных животных (домашних свиней и диких кабанов) с характеристикой как "инфицированные АЧС", то есть в основной массе они имели клинические признаки болезни, подтвержденные лабораторными исследованиями.
Похожие статьи
-
Таблица 3. Результаты сравнения различий чувствительности РПИФ и ПЦР при проверке парных выборок от домашних свиней и диких кабанов, инфицированных АЧС...
-
Таблица 2. Индивидуальные оценки диагностической чувствительности и специфичности РПИФ и ПЦР для подтверждения АЧС (WinEpiscope 2.0, Р=0,05) Вид Домашние...
-
Таблица 1 Размеры положительных АЧС выборок (количества страт и животных по видам), использованные в расчетах для определения диагностической...
-
Таблица 4. Расчеты надежности параллельной схемы выполнения системы "ПЦР-РПИФ" с учетом превалентности случаев АЧС в фермах разного размера (расчеты...
-
В статье представлены статистические параметры диагностической работы ПЦР и РПИФ, основанные на использовании сложного проекта стратифицированной выборки...
-
Введение - Исследование инкубационного периода при остром течении африканской чумы свиней
После первичного и последующих заносов вируса африканской чумы свиней (далее, АЧС) в Европу в XX г веке фундаментальные исследования болезни всегда...
-
Инкубационные периоды после экспериментальной парентеральной (внутримышечной и интраназальной) экспозиции полевых изолятов вируса АЧС 2007-2015 годов. У...
-
Резюме - Исследование инкубационного периода при остром течении африканской чумы свиней
Представлены результаты сравнений инкубационных периодов при острой форме течения АЧС с использованием экспериментальных моделей экспозиций свиней...
-
Материалы и методы. - Исследование инкубационного периода при остром течении африканской чумы свиней
Выборка данных инкубационных периодов из публикаций. Всего было идентифицировано и использовано 16 ранних (1958-1999 годы) и 5 поздних (2004-2013 годы)...
-
Синцитиальный метод при ранней идентификации вируса лейкоза крупного рогатого скота
Лейкоз крупного рогатого скота - злокачественное вирусное лимфопролиферативное заболевание. Ретровирус, относящийся к семейству Retroviridae, роду...
-
В системе мероприятий, направленных на повышение плодородия почв, получение высоких и устойчивых урожаев всех сельскохозяйственных культур и охрану почв,...
-
Введение - Физиологический статус организма свиней при использовании в рационе Лигногумата-КД-А
Интенсивное использование сельскохозяйственных животных приводит к ослаблению здоровья, сопровождается понижением физиологической реактивности и...
-
Резистентность сальмонелла ветеринарный Сальмонеллы относятся к семейству Enterobadteriadeae. роду Salmonella. Это большая группа, насчитывающая более 2...
-
Туберкулез. Основным методом прижизненной диагностики туберкулеза является аллергический. Позволяет выявлять больных с любыми формами туберкулеза,...
-
Введение - Антибиотикочувствительность бактерий, выделенных при отитах собак
На сегодняшний день большой интерес представляет роль бактериальных биопленок в патологических процессах. Биопленки - сложные микробные сообщества,...
-
Патологоанатомические признаки - Бешенство у животных
Предварительный диагноз ставят с учетом эпизоотологических и клинических показателей. Принимают во внимание характер эпизоотической ситуации в данной...
-
Методы сравнительной оценки быка-производителя по потомству зависят от места проведения, условий, в которых проводят оценку, а также от общей...
-
Смотри вопрос №7 Общие принципы серологических реакций и их использование в диагностике вирусных болезней В целях определения вида данного вируса при...
-
Вывод - Ветеринарно-санитарная экспертиза мяса при пироплазмидозах, фасциолезе и дикроцелиозе
В данной курсовой работе рассмотрены особенности ветеринарно-санитарной оценки при таких заболеваниях, как трематодозы и пироплазмидозы. Данные инвазии...
-
Лабораторные животные, цели и методы их использования в вирусологии - Ветеринарная вирусология
В связи с тем, что вирусы могут размножаться только в живых клетках, на самых ранних этапах развития вирусологии широко применяли культивирование вирусов...
-
При типичном течении актиномикоза поставить диагноз по клиническим признакам достаточно просто. В сомнительных случаях проводят лабораторные...
-
Введение - Эпизоотическая ситуация по колибактериозу поросят в Краснодарском крае
Несмотря на внедрение новых технологий содержания и кормления свиней, проблема, связанная с потерей мог лодняка на ранних этапах выращивания, является...
-
Крупа из проса (пшено) обладает высокой питательностью и хорошими вкусовыми качествами (табл. 1). Пшенная мука в чистом виде малопригодна для...
-
До начала полевых работ проведены организационно-технические мероприятия, направленные на создание безопасных и здоровых условий труда при выполнении...
-
Рынок недвижимости зависит от множества факторов, определяющих социально-экономическое развитие как страны в целом, так и отдельных регионов, в т. ч....
-
Введение - Использование различных способов обогрева в промышленном свиноводстве
Ключевой задачей животноводства является интенсификация, предполагающая рост продуктивности и Г экономической эффективности производства за счет...
-
В настоящее время обучение геоинформационным системам являются очень актуальными в связи с их широким использованием в последнее десятилетие в...
-
Современные условия хозяйствования повышает ответственность и самостоятельность предприятий в выработке и принятии управленческих решений по обеспечению...
-
Введение - Методы и функции прогнозирования и планирования при использовании земель с/х назначения
Система рационального использования земель является одной из наиболее острых глобальных проблем в связи с намечающимся продовольственным кризисом, но...
-
Заключение - Физиологический статус организма свиней при использовании в рационе Лигногумата-КД-А
Представленные результаты исследований свидетельствуют о положительном влиянии лигногумата-КД-А на организм свиней. Для коррекции иммунобиохимического...
-
РСК. Иммунологическая основа и характеристика компонентов реакции - Ветеринарная вирусология
Реакция связывания комплемента (РСК) -- одна из традиционных серологических реакций, применяемых для диагностики многих вирусных болезней. Само название...
-
Лабораторная диагностика - Лейкоз крупного рогатого скота
Диагноз на лейкоз ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков, патанатомических изменений и результатов лабораторных...
-
Схема лабораторной диагностики вирусных инфекций - Ветеринарная вирусология
Лабораторная диагностика - это система мер по обнаружению, индикации вируса. В нее входят: получение посланного патологического материла, исследование...
-
Материалы и методы исследований При написании данной курсовой работы я пользовалась ветеринарным законодательством том 4 (инструкция по борьбе с...
-
Лабораторная диагностика - Диагностика и лечение болезни Ауески у поросят
Основная схема лабораторной диагностики вирусных болезней включает: I .Вирусологический метод 1. Обнаружение вируса 1)микроскопией мазков (лучше...
-
Как известно, существует два типа кормления свиней жидкое и сухое. О преимуществах этих типов споры никогда не утихнут. Сегодня в мире сухой тип...
-
Методи розведення свиней - Селекція у свинарстві
Розведення свиня селекційний свинарство Методи розведення -- це система підбору в свинарстві з урахуванням породної та лінійної належності тварин для...
-
Наиболее удобной и естественной для восприятия человека формой отображения информации является ее объемное представление. Для ее создания использован...
-
Введение - Кормление сельскохозяйственных животных
Кормление производитель телочка рацион Знание научных основ и систем полноценного кормления животных, использование новейших достижений в области...
-
Материал для исследований от заболевших, павших или вынужденно убитых животных следует брать как можно быстрее после появления четких признаков болезни...
Введение - Диагностические оценки ПЦР и РПИФ при использовании выборки от полевых вспышек африканской чумы свиней