Введение - Диагностические оценки ПЦР и РПИФ при использовании выборки от полевых вспышек африканской чумы свиней

Основной особенностью семилетнего развития эпизоотического процесса АЧС в сильно структурированном свиноводстве Российской Федерации является наблюдаемая периодичность его активных фаз (эпизоотий) с короткими межэпизоотическими периодами с низкой или очень низкой месячной инцидентностью вспышек (спорадические случаи) как в стадах домашних свиней, так и популяциях диких кабанов. Инфекция АЧС всегда сопровождалась геморрагическим воспалением, коротким инфекционным периодом (5-7 дней) с последующим фатальным 100% исходом [1], что свидетельствует о высокой вирулентности вируса [1, 8, 9].

Сразу же, после интродукции вируса АЧС на территорию РФ, для подтверждения инфекции использовали лабораторные методы по ГОСТ 2857-90 "Свиньи. Методы лабораторной диагностики африканской чумы свиней" [3, 10]. Рекомендованные методы предназначались для диагностических исследований АЧС при острой (изоляция вируса с использованием культуры макрофагов in vitro и феномена гемадсорбции, реакция прямой иммунофлуоресценции, сэндвич ИФА), хронической и латентной формах течения (реакция непрямой иммунофлуоресценции, непрямой иммуноферментный анализ). Ранее, хорошая диагностическая эффективность этих реакций была признана экспертами МЭБ при ликвидации АЧС в Европе и Латинской Америке в 20 веке [13, 15]. Исторически, в РФ для указанных методов реагенты и наборы препаратов были разработаны еще в 70-80 годы прошлого столетия [2, 7], но имели статус валидированных только на основании использования выборки от экспериментальной инфекции АЧС. Первая публикация относительно ПЦР, как диагностического метода, была в 1992 году [14], а в РФ - в 1995 году [11]. Позднее, после усовершенствований, в практику диагностики АЧС была введена ПЦР в реальном времени [12], но вопросы валидации ПЦР (варианты электрофорезного и в реальном времени) практически были освещены очень ограниченно [4, 5, 6].

В связи с перманентным развитием эпизоотической ситуации, основной интерес властей к лабораторным исследованиям был основан, прежде всего, на необходимости быстрого подтверждения подозрения на АЧС. Благодаря активному влиянию госветслужбы, были организованы централизованные государственные закупки диагностических средств и оборудования, тренинг практических ветеринарных специалистов в научно-исследовательских учреждениях страны, поэтому ПЦР, РПИФ и ИФА были очень быстро внедрены в обычную практику ветеринарных лабораторий [9, 10]. С точки зрения объектов обнаружения, рассматриваемые реакции можно считать условно зависимыми (обе реакции обнаруживают вирус) и независимыми, так как на молекулярном уровне ПЦР обнаруживает фрагменты вирусспецифической ДНК, а РПИФ (или ИФА) - вирусспецифические полипептиды. Однако, хорошие научные знания принципа работы реакций и их блестящее техническое выполнение, могут объяснить только механизмы обнаружения компонентов вируса и представлять только свидетельства их обнаружения (то есть продукты амплификации или люминесцентная визуализация вирусных белков). Однако, для достижения основной цели лабораторных исследований - непредубежденно оценивать полученные результаты реакций и затем делать заключение "болезнь есть" или "болезни нет", требуются очень хорошо выверенные знания диагностических характеристик используемых методов. Поэтому, из-за отсутствия таких данных ветеринарным руководством было принято решение об обязательной перепроверке положительных результатов ПЦР и РПИФ (но не отрицательных), полученных практическими ветеринарными лабораториями на АЧС, в научных учреждениях (ВНИИВВиМ или ВНИИЗЖ).

Таким образом, имея в своем распоряжении данные масштабных лабораторных скринингов большого количества инфицированных АЧС и интактных домашних свиней и кабанов, выполненные ВНИ-ИВВиМ и практическими ветеринарными лабораториями в течение 2008-2013 годов, а также все выборки при вспышках, основной целью исследований было валидация ПЦР и РПИФ и оптимизация схемы выполнения для усиления законности лабораторных исследований на

АЧС.

Материалы и методы. Для выполнения РПИФ и ПЦР использовали коммерческие серии наборов и реагентов собственного производства:

    - "Специфические ФИТЦ-иммуноглобулины АЧС для им-мунофлуоресцентной диагностики африканской чумы свиней" - коммерческие серии ВНИИВВиМ; выполнение РПИФ в соответствии "Инструкции по применению"; - "Тест-система для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени" - коммерческие серии ВНИИВВиМ.

В практических ветеринарных лабораториях была использована также коммерческая тест-система "АЧС" для выявления генетического материала вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (производство ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии).

Учет результатов реакций был дихотомический (то есть "положительный" или "отрицательный"), несмотря на субъективные оценки по 4-х бальной шкале для РПИФ или инструментальные по Ct - оценкам для ПЦР.

Для индивидуальной оценки диагностических характеристик ПЦР и РПИФ использовали сложную выборку, которая включала полевые экспертизы, сгруппированные в страты, включавших пробы от всех павших домашних свиней или диких кабанов, классифицированные как "референс-положительные АЧС" (на основании опроса и идентифицированные как ПЦР-положительные и/или РПИФ-положительные практическими ветеринарными лабораториями). Так как типы проб были разными (для ПЦР использовали пробы крови/сыворотки, костного мозга, а для РПИФ - в основном, только селезенки), количества выборок для оценки каждой реакции также были разными.

Выборки "неинфицированных" домашних свиней и диких кабанов были из исторически свободных по АЧС территорий РФ.

Такой тип выборки для парных лабораторных исследований был использован для оценки различий диагностической чувствительности и согласованности реакций. Для этого выборки (п. 1.2.1.) были "нормализованы" по размеру и типу пробы, то есть для оценок реакций от каждого животного выборки отбирали парную пробу селезенки.

Кроме выборки павших животных, в исследованиях сравнений реакций также использовали парные пробы селезенок случайной выборки отстрелянных диких кабанов в неблагополучных по АЧС субъектах РФ.

Так как данный проект выборки предназначен для сравнения, размер и структура выборки были для каждой реакции одинаковыми.

При непарных лабораторных исследованиях было последовательное выполнение каждой реакции индивидуально, когда не все пробы могли быть проверены каждой реакцией. Данный проект был предназначен для определения индивидуальных диагностических характеристик ПЦР и РПИФ.

При парных лабораторных исследованиях - параллельное выполнение реакций, то есть тестирование одних и тех же проб ПЦР и РПИФ было предназначено для оценок различий чувствительности и согласованности реакций.

Использовали статистические методы определения величины диагностической чувствительности, диагностической специфичности с использованием таблицы 2*2 [11], различий (МсМетаг'в-статистика) и согласованности (каппа) реакций с использованием пакета программ WinEpiscope 2.0 и Medcalc 10. Для определения прогностических положительных и отрицательных результатов реакций (прогностических характеристик) и эффективности параллельного выполнения использовали данные превалентности АЧС в разных фермах домашних свиней [1] и программу "MultipleDiagnosticTest" пакета WinEpiscope 2.0.

Проект и процесс выборки, осуществляемые на основе использования полевых проб для валидации методов, очень трудны, поэтому требуют описания деталей и пояснения, чтобы дальнейшие интерпретации данных и выводы авторов были понятными. От корректности выборки зависит точность диагностических показателей и рекомендаций относительно стратегии применения лабораторных методов. В наших исследованиях выборки были выполнены практическими ветеринарными врачами при вспышках АЧС в период с 2008 по 2013 годы включительно в 30 субъектах Российской Федерации. Процедуры выборки чаще были от первично инфицированных АЧС павших свиней (целенаправленная выборка), но всегда имели элемент случайности, а также неконтролируемые вмешивающиеся факторы. Поэтому границы терминологии выборки междуэмпирической и случайной установить трудно и потребовалось немало усилий для селекции и приведения проб их в приемлемый статистический порядок. В таблице 1 приведены наиболее общие данные количеств обследованных животных (домашних свиней и диких кабанов) с характеристикой как "инфицированные АЧС", то есть в основной массе они имели клинические признаки болезни, подтвержденные лабораторными исследованиями.

Похожие статьи




Введение - Диагностические оценки ПЦР и РПИФ при использовании выборки от полевых вспышек африканской чумы свиней

Предыдущая | Следующая