Определение концентрации спермиев хряка при помощи оптического стандарта - Ветеринарно-санитарная экспертиза спермы сельскохозяйственных животных

В пустую пробирку вносят 1,0 мл 1%-ного раствора натрия хлорида. Микропипеткой набирают 0,1 мл свежеполученной профильтрованной спермы. Конец пипетки вытирают снаружи салфеткой, а затем два раза промывают ее раствором в пробирке. Пробирку слегка встряхивают и держат рядом со стандартом. Стандарт предварительно должен быть хорошо взболтан. К пробиркам сзади вплотную прикладывают лист с печатным текстом.

К исследуемой сперме добавляют пипеткой 1%-ный раствор натрия хлорида в таком количестве, чтобы высота букв шрифта и оптическая плотность были одинаковы со стандартом. Каждый раз при добавлении раствора содержимое пробирки и стандарт встряхивают для получения равномерной взвеси.

После того как оптическая плотность исследуемой спермы и стандарта совпадут, проводят расчет по формуле:

К = 50 (n + 0,1),

Где: К - концентрация спермы (млн./мл);

N - объем внесенного 1%-ного раствора натрия хлорида (мл);

50 - коэффициент.

Оптический стандарт соответствует оптической плотности спермы хряков с концентрацией спермиев 5 млн./мл. Пример: Для выравнивания оптической плотности до стандарта к исследуемой сперме добавлено всего 4,5 мл 1%-ного раствора натрия хлорида (с учетом ранее налитого в пустую пробирку).

К = 50 х (4,5 + 0,1) = 50 х 4,6 = 230 (млн./мл)

Следовательно, в 1 мл исследуемой спермы содержится 230 млн. спермиев.

Определение концентрации спермиев жеребца по стандартам

Стандарты представляют собой стеклянные запаянные пробирки одинакового диаметра, с жидкостью имитирующей сперму жеребца разной концентрации: 10 - 20 - 200 - 300 и 500 млн. спермиев в 1 мл.

Сперму наливают в прилагаемую пустую пробирку такого же диаметра, и сравнивают со стандартом. Стандарты, предварительно встряхивают, чтобы осадок равномерно размешался. Пробирки просматривают на свет, при этом подбирают стандарт, наиболее близкий по густоте к определяемой сперме, который и принимают за ее концентрацию. Концентрация спермиев может быть определена и как промежуточная между двумя стандартами.

При концентрации более 500 млн. спермиев в 1 мл сперму можно разбавлять 7%-ным раствором глюкозы в 2 раза (1: 1), затем установить концентрацию по стандартам и сделать соответствующий пересчет на неразбавленную сперму.

Для большей точности определения к сравниваемым пробиркам сзади вплотную прикладывают стеклянную палочку.

Определение интенсивности дыхания спермиев

Метод основывается на том, что в анаэробных условиях спермин используют для дыхания кислород из молекул метиленового синего, в результате чего раствор обесцвечивается. Поскольку дыхание происходит под влиянием дегидрогеназы, то по существу скорость обесцвечивания раствора метиленового синего показывает активность названного энзима.

Для определения на теплое (30-370С) предметное стекло наносят каплю, спермы и каплю метиленового синего (30 0С). Капли быстро перемешивают, и смесь набирают в два теплых стеклянных капилляра длина которых должна быть не менее 5-6 см и диаметр 0,8-1,0 мм. Длина столба в трубке должна быть примерно 2-3 см. В столбе смеси не должно быть пузырьков воздуха. Капилляры кладут горизонтально и помещают в термостат (+ 37 0С) на белую бумагу. Регистрируют время (таблица 3), в течение которого обесцвечивается раствор метиленового синего.

Таблица 3 - Оценка качества спермы по времени обесцвечивания метиленовой сини (в минутах)

Качество спермы

Бык

Баран

Хорошее

5 - 10

3 - 7

Среднее

11 - 30

8 - 12

Плохое (непригодное для использования)

Более 30

Более 12

Результат является более объективным, если вычисляют и активность дегидрогеназы, поскольку с помощью этого показателя учитывается как подвижность спермиев, так и их концентрация.

Активность дегидрогеназы в условных единицах получают по формуле:

Да = (ПсЧtЧС)/10,

Где:

Да - активность дегидрогеназы;

Пс - подвижность спермиев в баллах;

T - время обесцвечивания раствора метиленового синего в минутах;

С - концентрация спермиев (млрд./мл).

Допустимая активность дегидрогеназы должна быть в сперме быка в пределах 16,8 у. е., для барана 9,6 у. е. пределах 16,8 у. е., для барана 9,6 у. е.

Определение абсолютной выживаемости спермиев

Под выживаемостью спермиев подразумевают продолжительность их жизни вне организма в определенных условиях. Это важный показатель качества спермы, поскольку он дает возможность предсказать оплодотворяющую способность спермы. Выживаемость спермиев выражается абсолютной выживаемостью (S).

Для определения абсолютного показателя выживаемости спермиев берут 11 стерильных пробирок емкостью по 2 мл и нумеруют восковым карандашом. Во все пробирки, за исключением первой, наливают по 0,5 мл синтетической среды. В первую и вторую пробирки вносят по 0,5 мл неразбавленной спермы. Первая пробирка в дальнейшем служит контролем.

Сперму во второй пробирке тщательно перемешивают со средой путем пипетирования и из нее переносят 0,5 мл в третью пробирку; в третьей пробирке смесь перемешивают и переносят в четвертую и т. д. Из последней пробирки (11-ой) 0,5 мл смеси выливают. Таким образом, в первой пробирке сперма не разбавленная, а в пробирках со 2 по 11-ую сперма разбавлена в 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024 раза.

Из каждой пробирки на теплое предметное стекло берут каплю, спермы и оценивают подвижность. Пробирки устанавливают в штатив, закрывают стерильными пробками и ставят на хранение в термос со льдом.

В последующем ежедневно оценивают подвижность спермиев под микроскопом при температуре 40 0С. Оценку подвижности проводят до установления гибели всех спермиев во всех пробирках. Результаты исследований заносят в таблицу. Показатель абсолютной выживаемости (S) определяют по формуле:

S = а 1t 1 + а 2t 2 + a 3t 3+ ... a nt n

Где: а 1, а 2, а 3 , аn - подвижность спермиев за интервалы времени, в балах;

T1 , t 2 , t 3 , tn - последовательные интервалы времени, в часах. Интервалы времени в часах определяются по формуле:

T = (Т n+1 - Т n-1)/2

Где: Т - часы опыта,

Т n+1 - время в часах от начала опыта до последующего определения подвижности;

Т n-1 - время в часах от начала опыта до предыдущего определения подвижности.

Хорошая сперма быка и барана, разбавленная синтетической средой в 16-32 раза, должна иметь показатель абсолютной выживаемости спермиев не ниже 1 400, хряка - 900, жеребца - 400 и выше.

Похожие статьи




Определение концентрации спермиев хряка при помощи оптического стандарта - Ветеринарно-санитарная экспертиза спермы сельскохозяйственных животных

Предыдущая | Следующая