Определение концентрации спермиев в сперме производителей - Ветеринарно-санитарная экспертиза спермы сельскохозяйственных животных

Определение концентрации спермиев в счетной камере.

Концентрация спермиев в сперме -- это степень насыщенности спермы сперматозоидами. Она выражается количеством спермиев в 1 мл в миллиардах.

Определение концентрации спермиев в сперме складывается из: разбавления спермы в смесителе; подготовки счетной камеры; зарядки счетной камеры; подсчета спермиев; вычисления концентрации исследуемой спермы.

Разбавление спермы в меланже. Для определения концентрации спермиев необходимо разбавить сперму в строго определенное количество раз. Для спермы быка и барана применяют эритроцитарный смеситель (с красным шариком), а для спермы хряка и жеребца - лейкоцитарный (с белым шариком).

В меланжер набирают сперму до метки 0,5, а затем 3-ный раствор натрия хлорида до верхней метки. Эту работу необходимо выполнить очень точно. Зажимают большим и указательным пальцами оба конца меланжера и встряхивают его в течение 2-3 минут до полного перемешивания спермы с раствором.

Подготовка счетной камеры. Счетная камера с сеткой Горяева -- это толстое предметное стекло, поверхность которого бороздками разделена на три части. На среднем, окруженном бороздками поле, находится счетная сетка, площадь которой равна 9 мм2. Это поле разделено на 225 больших квадратов, из них 25 в свою очередь разделены на 16 малых квадратиков. Площадь каждого малого квадратика составляет 1/400 мм2.

Счетную камеру и покровное стекло протирают тампоном, смоченным в смеси спирта и эфира (поровну). Вытирают насухо марлевой салфеткой. Покрывают камеру покровным стеклом и притирают стекло к крайним пластинкам до появления радужных колец.

Зарядка счетной камеры. Из капилляра меланжера удаляют на сухой тампон первые 2-3 капли разбавленной спермы, 4-5-ую капли наносят на среднюю часть камеры у самого края притертого покровного стекла.

Подсчет спермиев. Камеру помещают на предметный столик микроскопа. Под малым увеличением находят сетку камеры, а затем переводят увеличение в 200-300 раз. Подсчет спермиев производят в 5-ти больших квадратах, которые разделены на маленькие. Считают в квадратах, расположенных по диагонали или по углам и в центре. Считают головки спермиев, расположенные внутри маленьких квадратов, и на верхней и левой линиях.

Вычисление концентрации спермиев. Концентрацию спермиев определяют по формуле:

С = (400 П. Д)/(N Р.1000000),

Где: С - концентрация спермиев;

П -- число подсчитанных спермиев;

Д -- степень разбавления;

N - число сосчитанных малых квадратов (80);

Р - глубина камеры (О, 1 мм); 400 - множитель, введен в формулу для пересчета в 1 мм, так как площадь малого квадрата равна 1/400 мм2.

Для точности определения концентрации спермиев рекомендуется заправлять обе сетки и при подсчете брать средний показатель. Расхождение результатов не должно превышать 10%. Если разница больше 10%, подсчет повторяют третий раз и берут среднее из двух подсчетов, расходящихся не более чем на 10%.

Определение концентрации спермиев на фотоэлектроколориметре ФЭК-М.

Метод определения концентрации спермиев при помощи ФЭК-М основан на способности спермы ослаблять пропускаемый через нее пучок света пропорционально концентрации спермиев, то есть чем выше концентрация спермиев, тем больше ослабляется проходящий пучок света. Величина ослабления светового пучка регистрируется чувствительными фотоэлементами.

Определение концентрации на ФЭК-М начинают спустя 15-20 минут после включения лампы и засветки фотоэлементов. Для повышения точности исследований рукояткой устанавливают красные светофильтры. Левый отсчетный барабан рукояткой выставляют на "О" по красной шкале (шкала оптической плотности).

Во флакон наливают 10 мл 3,5%-ного раствора натрия лимоннокислого вносят в него 0,1 мл спермы быка (сперма разбавляется в соотношении 1:100). Сперму барана разбавляют в соотношении 1: 400, то есть берут 10 мл 3,5%-ного раствора натрия лимоннокислого и 0,025 мл спермы. Сперму хряка разбавляют в соотношении 1: 30, то есть к 12 мл 3,5%-ного раствора натрия лимоннокислого добавляют 0,4 мл спермы, которая предварительно должна быть профильтрована через 2 слоя капроновой ткани для отделения студенистого секрета.

Перед внесением пробы спермы в раствор микропипетку необходимо снаружи вытереть чистой марлевой салфеткой. После внесения спермы в раствор микропипетку надо 2-3 раза прополоскать в этом же растворе путем насасывания и выдувания. Температура 3,5%-ного раствора натрия лимоннокислого должна быть в пределах 18-25 оС.

После разбавления сперму тщательно перемешивают и наливают в кювету с рабочей длиной 10 мл до метки и быстро определяют оптическую плотность. Для этого на путь прохождения пучка света ставят в левый кюветодержатель чистую кювету с рабочей длиной 10 мм, наполненную 3,5%-ч раствором натрия лимоннокислого, а в правый кюветодержатель - 2 такие-к же кюветы: одну с разбавленной спермой, другую с 3,5%-ным раствором натрия лимоннокислого. При этом кювету с разбавленной спермой устанавливают на пути прохождения пучка света (как и в левом кюветодержателе), а кювету с раствором в запасное гнездо этого же кюветодержателя. Кюветы необходимо устанавливать перпендикулярно к пучку света.

Закрывают крышку прибора и включают гальванометр рукояткой сначала на грубую чувствительность в положение "1". Рукояткой нейтральных клиньев подводят стрелку гальванометра к "0", затем включают гальванометр на высокую чувствительность, в положение "2" и точно устанавливают стрелку на "0". Затем гальванометр сразу же переводят на грубую чувствительность в положение "1". Меняют в правом кюветодержателе местами кюветы так, чтобы на пути прохождения света стала кювета с 3,5%-ным раствором натрия лимоннокислого. Это достигается путем поворота кюветодержателя вокруг оси.

Опустив крышку прибора, опять включают гальванометр сначала на грубую чувствительность (не трогая ручку нейтральных клиньев) рукояткой барабана подводят отклонившуюся стрелку гальванометра на "0". Включают гальванометр на высокую чувствительность, точно устанавливают стрелку на "0", Рукоятку гальванометра переводят в положение "0".

Отсчет берут по красной шкале левого барабана и смотрят, какой величине концентрации он соответствует на калибровочной кривой, которую выводят заранее.

Построение калибровочной кривой. Для определения концентрации спермиев на ФЭК-М необходимо предварительно построить калибровочную кривую, изображающую зависимость оптической плотности от концентрации змиев.

Для построения калибровочной кривой из свежевзятых эякулятов выбирают несколько таких, в которых концентрация спермиев наиболее высокая. Тщательно определяют концентрацию спермиев в счетной камере.

Из отобранных эякулятов путем разбавления их 3,5%-ным раствором лимоннокислого натрия 1: 1, 1: 2, 1: 3 и т. д. готовят ряд образцов спермы и определяют концентрацию спермиев в каждом из них в счетной камере.

Определяют величину оптической плотности каждого образца на приборе, как описано в предыдущей методике. Зная фактическую концентрацию спермиев, установленную в счетной камере, строят калибровочную кривую. Для этого на миллиметровой бумаге откладывают: по горизонтальной оси - известные концентрации спермиев каждого образца, по вертикальной оси - соответствующие им величины оптической плотности. В местах пересечения перпендикуляров ставят точки, калибровочную кривую проводят так, чтобы она прошла через большинство указанных точек, а число точек, лежащих выше или ниже калибровочной кривой, было примерно одинаковым.

Кривая не должна быть сильно изогнутой или изломанной.

Имея калибровочную кривую, можно легко определить неизвестную концентрацию спермиев любого эякулята. Для этого нужно лишь установить его оптическую плотность на приборе, как указано выше и посмотреть какой причине концентрации она соответствует на калибровочной кривой. При этом следует строго соблюдать все условия исследования, при которых выведена и калибровочная кривая. Надо применять ту же кратность разбавления спермы, использовать кюветы той же рабочей длины, те же светофильтры и тот же способ отсчета величин оптической плотности.

Калибровочную кривую следует ежемесячно проверять, так как показания прибора могут изменяться.

Точность электрофотометрического метода определения концентрации спермиев и источник ошибок. По точности электрофотометрический метода определения концентрации спермиев почти не уступает методу определения в счетных камерах. Величина ошибки колеблется в пределах 6%.

Эта величина ошибки обусловлена в основном влиянием плазмы спермы и неточностью взятия проб. Влияние пигментации плазмы на точность результатов исследования ослабляется применением красных монохроматических светофильтров.

Похожие статьи




Определение концентрации спермиев в сперме производителей - Ветеринарно-санитарная экспертиза спермы сельскохозяйственных животных

Предыдущая | Следующая