МОДИФІКОВАНІ ПРИСТРОЇ І МЕТОДИ АНАЕРОБНОГО КУЛЬТИВУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ, ПОШИРЕННЯ ЦЕЛЮЛОЛІТИЧНИХ І МЕТАНУТВОРЮЮЧИХ МІКРООРГАНІЗМІВ У РІЗНИХ ЕКОСИСТЕМАХ - Роль анаеробних мікроорганізмів у трансформації сільськогосподарської сировини в біопаливо

Крім загальноприйнятих методів та пристроїв, описаних у літературі, для виділення облігатних анаеробних мікроорганізмів з метою утилізації сільськогосподарської продукції було розроблено власні пристрої: культиватор для визначення параметрів росту анаеробів, газовий зонд-фіксатор для видалення кисню з культиваторів і пробірок, пристрій для "холодної" стерилізації термолабільних речовин в анаеробних умовах, скляний анаеростат для культивування анаеробних мікроорганізмів на щільних середовищах. Розроблені пристрої і методи анаеробного культивування враховують специфіку роботи з мікроорганізмами в анаеробних умовах, дають змогу проводити фундаментальні дослідження з виділення чистих культур анаеробних мікроорганізмів у стерильних умовах, вивчати їх фізіолого-біохімічні властивості, отримувати достовірні, добре відтворювані результати.

ПОШИРЕННЯ ЦЕЛЮЛОЛІТИЧНИХ І МЕТАНУТВОРЮЮЧИХ МІКРООРГАНІЗМІВ У РІЗНИХ ЕКОСИСТЕМАХ

Було проведено обстеження низки екосистем з метою визначення місць існування первинних - целюлолітичних і вторинних - метанутворюючих бактерій. Було відібрано близько 300 проб у Кримській, Запорізькій, Кіровоградській та інших географічних зонах. Екосистеми, що досліджували, включали: прісні водойми (р р. Дніпро, Луга), солоні водойми (Сакський лиман, озеро Сиваш, Чорне та Біле моря), сільськогосподарські та побутові відходи, грунти. Зразки для виділення целюлолітичних і метанутворюючих бактерій розрізнялися за рядом фізико-хімічних параметрів: ступенем загальної мінералізації, вмістом NaCl і мікроелементів, рН та температурним режимом.

У пробах Чорного моря активний метаногенез спостерігали у зразках з недостатнім водообміном і сприятливими умовами анаеробіозу. У пробах води Білого моря, де загальна мінералізація морської води становила 30-35 г/л, рН води змінювалось від 6,7 до 8,1 з перевагою лужних значень (8,0), наявність целюлолітичних і метанутворюючих бактерій незначна. Обстеження еконіш тундрової зони Західного Сибіру виявило, що процес кругообігу метану в цих водоймах відбувається на низькому рівні й майже виключно в донних відкладеннях.

Серед екосистем, де активно відбуваються процеси утворення метану, важлива роль належить сільськогосподарським, побутовим та виробничим стокам. Особливістю цих екосистем є висока концентрація органічних речовин, відносно швидке споживання їх мікроорганізмами, а також постійна температура (у метантенку). Ці умови спричиняють масовий розвиток усіх організмів ланцюга анаеробного розкладання органічних речовин, включаючи метаногени.

Із 300 досліджуваних зразків було виділено накопичувальні анаеробні культури (80 целюлолітичних та 65 метаногенних), що трансформують С1 -С2 Органічні сполуки, целюлозу, гній, послід у біопаливо.

Метанутворюючі археї виділено на всіх субстратах, що використовують метаногени для росту і метаболізму - ацетаті, метанолі, метиламіні, водень-вуглекислотній суміші.

Найактивніший ріст накопичувальних культур з утворенням метану спостерігали на середовищі "Р" з водень-вуглекислотною сумішшю, метанолі, форміаті, целюлозі, посліді. Слабкий - з використанням метиламіну. З солоних водойм (Чорне море) виділено помірні галофіли з концентрацією NaCl -10-15г/л (табл.1).

Целюлолітичні бактерії, що здатні до гідролізу рослинної сировини, виділені з солоних водойм, мулу метантенку, пташиного посліду, грунту. Серед них - представники психрофільних (20-22ОС), мезофільних (30-40ОС) і термофільних (50-70ОС) груп мікроорганізмів. pН середовища 6,0-8,0. Культури подібні за синтезованими продуктами метаболізму: етанолом, ацетатом, лактатом, воднем, вуглекислотою. Активне газоутворення (СН4, Н2, СО2) спостерігали у досліджених зразках мулу метантенку при температурі 55-70ОС.

Отримані дані свідчать про значну видову різноманітність анаеробних целюлолітичних та метанутворюючих мікроорганізмів. Порівняльна оцінка наявності метанутворюючих і целюлолітичних мікроорганізмів у різних природних екосистемах показала, що присутність їх взаємозалежна тому, що продукти трансформації первинних анаеробів є субстратами для росту метаногенних археїв.

Таким чином, з різних екосистем (солоні та прісні водойми, сільськогосподарські, побутові відходи) виділено накопичувальні культури анаеробних мікроорганізмів, що трансформують С1-С2 Органічні сполуки, целюлозу, гній, послід у біопаливо.

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕРМОФІЛЬНИХ АНАЕРОБНИХ МІКРООРГАНІЗМІВ МЕТАНТЕНКА

З активного мулу метантенка станції біологічного очищення стічних вод (СБО, Бортничі, м. Київ) було відселекціоновано активну термофільну накопичувальну культуру, що стабільно гідролізувала целюлозу до метану за 5-7 діб за температури культивування 60ОС. З накопичувальної метаногеної культури, надалі було ізольовано штами: первинних анаеробів, що гідролізують целюлозу (целюлолітичні бактерії), бродильних (сахаролітичні бактерії) і вторинних анаеробів - метанутворюючих археїв.

Характеристика целюлолітичного штаму 5СТ : Прямі, ледве вигнуті палички розміром 0,5-0,6Ч1,5-2,5 мкм, поодиноки, парні або в ланцюгах до 10 мкм. Грамнегативні. За несприятливих умов культивування (pН нижче 6,4, температура понад 70ОС) утворюють термінально розташовані ендоспори. На поверхні щільного середовища культура утворює дрібні, круглі, білі або прозорі колонії розміром 1-2

Мм. У глибині целобіозного агару - колонії бобовидні, білі. Облігатний анаероб.

55-60ОС. Оптимальне значення pН 7,0-7,5, ріст не спостерігається при pН понад 8,0 і нижче 6,5.

При вивченні здатності виділеного штаму використовувати для росту різні джерела вуглецю встановлено, що штам 5СТ здатний ферментувати крім целюлози і целобіози також арабінозу, глюкозу, галактозу, сахарозу, ксилозу, слабо - фруктозу. На живильних середовищах МПА, МПБ, КПА не росте. Ріст спостерігали на мінеральному середовищі "Р" з дріжджовим екстрактом або вітамінами. На рідкому середовищі з целюлозою культура утворює жовтий пігмент. Ця властивість втрачатися за багаторазових пересівах, але здатність гідролізувати целюлозу зберігається. При рості на целобіозі, глюкозі, фруктозі проявляється слабка пігментація. Індол не утворюється. Каталаза й оксидаза - відсутні. Основними екзометаболітами є водень, вуглекислий газ, етанол, ацетат та лактат. Желатину не розріджує, нітратів не відновлює. Значення показника вмісту нуклеотидів Г+Ц у ДНК становить 39,04 моль %.

Характеристика сахаролітичного штаму 1S: Рухомі палички, поодиноки, парні або утворюють довгі ланцюги. Штам 1S має розміри клітин: 0,6-0,8Ч3,0-5,0 мкм. В експоненціальній фазі росту - негативна реакція при фарбуванні за Грамом, при переході в стаціонарну фазу - грампозитивна. На середовищі з целобіозою (22-30 год) та на середовищі з ксилозою або арабінозою (10 год)- утворює термінальні, круглі спори. Поверхневі колонії біло-кремові, блискучі, опуклі, 1-2 мм у діаметрі, з рівними краями. Глибинні колонії - дрібні, ланцетоподібні. Облігатний анаероб. Росте в діапазоні температур 45-70ОС, оптимальна температура - 55-60ОС. Оптимальне значення pН 7,0-7,3. Ріст не спостерігається при рН нижче 5,0 і понад 8,0.

Штам 1S росте на середовищі "P" з додаванням дріжджового екстракту або вітамінів. Використовує різні джерела вуглецевого живлення: глюкозу, фруктозу, целобіозу, сахарозу, крохмаль, галактозу, лактозу, рибозу, маннозу, мальтозу, ксилозу, арабінозу. Не використовує: целюлозу, саліцин, манітол, ескулін, амигдалін. Основними продуктами ферментації є водень, вуглекислий газ, ацетат, етанол, бутират, лактат, у незначних кількостях утворює пропіонат. Желатину не розріджує, індолу не утворює, нітратів не відновлює. Вміст нуклеотидів Г+Ц у ДНК становить 31,9 моль%.

На підставі фізіолого-біохімічних і морфолого-культуральних ознак ізольовані штами 5СТ й 1S віднесено до роду Clostridium.

Властивості дослідженого штаму 5СТ порівнювали з властивостями термофільних клострідій, здатних гідролізувати целюлозу та її похідні - Clostridium thermocellum, C. stercorarium, C. cellulosi, C. thermocopriae, C. sraminisolvens. За більшістю ознак, виділений штам 5СТ більш подібний до C. thermocellum. Однак, на відміну від типового штаму C. thermocellum, штам 5СТ ферментує ширше коло субстратів (арабінозу, галактозу, сахарозу, глюкозу, слабко - фруктозу). Значення показника вмісту нуклеотидів Г+Ц у ДНК підтвердило належність дослідженого нами штаму до даного виду, для якого значення Г+Ц у ДНК перебуває в межах 38-40 моль %.

Властивості штаму 1S порівнювали з властивостями сахаролітичних бактерій C. thermosaccharolyticum, C. thermobutyricum, C. thermohydrosulfuricum. Найближче штам 1S до C. thermosaccharolyticum, але штам 1S утворює (крім етанолу, ацетату,

Бутирату) пропіонат при рості на середовищі з целобіозою. Вміст Г+Ц у ДНК штаму 1S становить 31,9 моль %, що дало змогу віднести його до виду Clostridium thermosaccharolyticum.

Характеристика метанутворюючого штаму 13М: Клітини штаму 13М - палички, розміром 0,5-0,6Ч7-100 мкм, вигнуті, утворюють ланцюги до 100мкм. Грампозитивні, нерухомі. Поверхневі колонії опуклі, з рівним краєм, коричнюваті, округлої форми, 1-2 мм у діаметрі. У рідкому середовищі культура росте у вигляді опалесцентної суспензії. Ріст та утворення метану штамом 13М спостерігали на мінеральному середовищі "P" з водень-вуглекислотною сумішшю як единим джерелом вуглецю й енергії. Ріст відсутній на середовищі з ацетатом, форміатом, метанолом, метиламінами. Облігатний анаероб. Ріст й утворення метану відбувається в діапазоні температур 40-65ОС, з оптимумом 55-60ОС. Діапазон рН 6,5-8,0, оптимальне pН 7,0-7,5. Ріст стимулюється внесенням у середовище дріжджового екстракту.

Порівняння діагностичних ознак штаму 13М з описаними термофільними метаногенами дало змогу віднести його до роду Methanobacterium.

Характеристика метанутворюючого штаму 84MS: Клітини штаму - коки (1-2 мкм у діаметрі), які розмножуються дробленням у різних напрямах і поєднуються по 2, 4, 8 у сарциноподібні нерухомі пакети (біотип I). Колонії на щільному середовищі - зернисті, жовтуватого кольору 0,5-1 мм у діаметрі. Облігатний анаероб. Ріст та утворення метану штамом 84МS спостерігали на мінеральному середовищі "Р" з субстратами: метанолом, ацетатом, метиламінами, повільно - на водень-вуглекислотній суміші. Росте в діапазоні температур 30-60ОС, з оптимумом 55ОС; при значеннях pН від 6,0 до 8,0 з оптимумом 6,8-7,0. Ріст і метанутворення стимулювали додаванням дріжджового екстракту. Порівняння властивостей виділеного штаму 84МS з відомими термофільними метаногенами дало змогу віднести його до роду Methanosarcina.

Таким чином, з термофільного метаногенного біоценозу активного мулу метантенка ізольовано термофільні анаеробні штами мікроорганізмів, які можуть трансформувати складні органічні речовини в біопаливо. На підставі морфолого-культуральних та фізіолого-біохімічних властивостей виділені штами ідентифіковано як Clostridium thermocellum 5CT, Clostridium thermosaccharolyticum 1S, Methanobacterium Sp. 13M, Methanosarcina Sp. 84MS.

Похожие статьи




МОДИФІКОВАНІ ПРИСТРОЇ І МЕТОДИ АНАЕРОБНОГО КУЛЬТИВУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ, ПОШИРЕННЯ ЦЕЛЮЛОЛІТИЧНИХ І МЕТАНУТВОРЮЮЧИХ МІКРООРГАНІЗМІВ У РІЗНИХ ЕКОСИСТЕМАХ - Роль анаеробних мікроорганізмів у трансформації сільськогосподарської сировини в біопаливо

Предыдущая | Следующая