МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, Материал исследования, Выделение ДНК - Изучение биоразнообразия популяции крупного рогатого скота

Материал исследования

Исследование проводилось в 2014 году в период с 17.06.14 по 27.07.14 и с 02.09.14 по 12.10.14. В лаборатории биотехнологии генотипировано 100 голов быков - производителей голштинской черно-пестрой породы, принадлежащих различным племенным предприятиям: ОАО "ГЦВ", ОАО "Московское" по племенной работе, ОАО "Краснодарское" по племенной работе, ГУПП РК "Карелиягосплем", ОАО "Невское" по племенной работе и ОАО "Племпредприятие "Череповецкое", рожденные во временном интервале с 1982 по 2012 года.

В качестве материала для выделения ДНК служила сперма быков-производителей.

Источниками информации о происхождении и оценке быков-производителей стали их племенные свидетельства и данные каталогов племпредприятий.

Выделение ДНК

При выделении ДНК из спермы нами использовались наборы реагентов Diatom™ DNA Prep 100 ООО Лаборатория "Изоген" г. Москва.

    1. Первичная обработка образцов. - Семя размораживаем. 100 мкл переносим в чистую пробирку, добавляем 240 мкл лизирующего раствора (Lysisreagent), 20 мкл ДТТ на каждые 10 проб, термостатируем смесь при 65 ?С 40 мин. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин. Переносим супернатант в чистую пробирку. - К 100 мкл крови добавляем 400 мкл лизирующего раствора (Lysisreagent). Приступаем к выделению без термостатирования. 2. В пробирку с лизатом добавляем 20 мкл суспензии сорбента (диатомовые водоросли). Перед этим сорбент встряхиваем на вортексе. Ротируем 10 мин. 3. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин. 4. Осторожно, не задевая осадка, удаляем супернатант с помощью водоструйного насоса. К осадку прибавляем 200 мкл лизирующего раствора. 5. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин. 6. Удаляем супернатант. К осадку добавляем 1 мл рабочего однократного раствора солевого буфера (десятикратный солевой буфер (1М хлорид натрия (NaCl) и 1M хлорид калия (KCl)) разводим водой до 100 мл, а затем 96% этиловым спиртом до 300 мл и перемешиваем). 7. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин. 8. Удаляем супернатант, к осадку добавляем 1 мл рабочего раствора солевого буфера, перемешиваем, центрифугируем десять секунд при 5000 об. 9. Удаляем супернатант. Убираем полосками фильтровальной бумаги остатки жидкости над сорбентом, меняя полоски от пробы к пробе. 10. Осадок сушим в термостате при 65 ?С пять минут. 11. К осадку добавляем 100 мкл ЭкстраГена (10% смесь ионообменников (типа Chelex), и 0,01% тритон X-100). Пробирку с ЭкстраГеном хорошо перемешать. Затем ресуспендируем на вортексе и термостатируем пять минут при 65 ?С. 12. Центрифугируем при 12000 об/мин 13. Перенести содержащую ДНК надосадочную жидкость (80 мкл) в чистую пробирку.

Выход ДНК составлял 3-5 мгк/100 мкл с OD 260/280 от 1,6 до 2,0.

Похожие статьи




МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, Материал исследования, Выделение ДНК - Изучение биоразнообразия популяции крупного рогатого скота

Предыдущая | Следующая