Лабораторная диагностика - Диагностика и лечение болезни Ауески у поросят

Основная схема лабораторной диагностики вирусных болезней включает:

I.Вирусологический метод

    1. Обнаружение вируса 1)микроскопией мазков (лучше отпечатков) на тельца-включения (ТВ) А)Обычная Б) Люминесцентная -метод флуорохромирования (МФ) -методы флуоресцирующих антител (МФА) В) электронная 2) индикация вирусов - РГА, РГАд 2.Выделение Вируса заражением чувствительных (3-5пассажей) А)лаб. животных Б) куриных эмбрионов (КЭ) В)культур тканей (КТ) 3.Идентификация Вируса (определение вида),типизация (определения типа, варианта) и дифференциация

II.Серологический метод (испытуемые сыворотки на наличие антител-Ат),постановкой реакций с известными биофабричными вирусными антителами: РН, РСК, РИД(РДП), РИЭОФ, МФА, ИФА, РЗГА (РТГА), РНГА, РЗГАд. [7]

Вирусоскопия. Не проводится.

Электронно-микроскопическая диагностика. Метод электронной микроскопии позволяет обнаружить вирус болезни Ауески через сутки после экспериментального заражения в мазках-отпечатках, которые готовят непосредственно на электронно-микроскопических сеточках со слизистой оболочки глаза, носа, ротовой полости и из мочи.[7]

ГОСТ 25753-83 устанавливает методы лабораторной диагностики болезни Ауески. Рассмотрим метод биологической пробы, сущность которого заключается в воспроизведении болезни у здоровых кроликов путем инокуляции патологического материала. Для проведения биологической пробы используют кроликов массой 2-2,5 кг. Подготовленный материал, надосадочную жидкость вводят двум кроликам внутримышечно в дозе 1-2см2. Биопробу считают положительной, если животные погибают с клиническими признаками болезни Ауески (нервная клиника, зуд, расчесы)через 2-10 сут после инокулирования суспензии патологического материала. Если животные погибают без признаков болезни Ауески, биопробу повторяют, используя патологический материал первого пассажа. Гибель кроликов после введения суспензии патологического материала от свиней без признаков зуда и расчесов может свидетельствовать о выделенных вакцинных штаммов вируса болезни Ауески.

Так же для индикацию вируса в патологическом материале можно проводить с помощью экспресс-методов(ПЦР, РИФ, РНГА, ИФА).

Серологическая идентификация. Для идентификации вируса болезни Ауески используют в основном РН в культуре клеток или на кроликах, метод флюоресцирующих антител, РДП, РНГА, ELISA-метод и др.

РН.Удобный и надежный метод идентификации выделенного вируса. Используют культуру клеток того же вида, на который был изолирован вирус. Реакцию ставят по общепринятой методике, чаще используют вариант: различные разведения сывороткиЙ (10-1-10-7) и постоянную дозу сыворотки. Перед постановкой реакции культуральный вирус размораживают, центрифугируют в течение 30 мин при 2-3 тыс. об/мин и в реакции используют надосадочную жидкость. Положительную и отрицательную сыворотку разводят 1:10 питательной средой для культуры клеток, содержащей антибиотики и прогревают при 56?С 30 мин. Результаты РН учитывают по ЦПД через 2-3 сут.

Готовят двукратное разведение в испытуемых сывороток от 1:2 до 1:16 на питательной среде для культуры клеток с антибиотиками. Затем готовят необходимый объем вируса, содержащего 1000ТЦД50/0,1см3 и добавляют равный объем его в каждую пробирку с последовательными разведениями сывороток. Смесь сывороток и вируса встряхивают, выдерживают при температуре 37?С в течение 30мин. По истечении указанного срока в пробирки вносят по 1,8 см3 поддерживающей питательной среды. Одновременно ставят следующие контроли:

    -контроль незараженных культур клеток в 3-4 пробирках, в которых проводят смену питательной среды; -контроль дозы вируса. Для контроля точности дозы вируса, взятой в реакцию, из рабочего разведения вируса (1000ТЦД50/0,1см3) готовят разведения до 10-4. Для каждого разведения вируса используют 3-4 пробирки с культурой клеток. В пробирки с культурой клеток вносят рабочие разведение вируса и последовательные его разведения в объеме по 0,1 см3.После контакта при температуре 37?С в течение 30 мин в пробирки с культурой клеток добавляют 1,9 см3 поддерживающей питательной среды; -контроль токсичности сыворотки. Для определения токсичности сыворотки в пробирочные культуры вносят по 0,1см3 разведения сыворотки и по 1,9см3 поддерживающей питательной среды (3-4 пробирки); -контроль специфичности вируса. Пробирки с культурой клеток инфицируют смесью вируса в рабочей дозе с двухкратном разведением специфической сыворотки до ее титра.

Результат серологического исследования испытуемых сывороток считают положительной при отсутствии цитопатического действия в разведениях сыворотки 1:2 и выше при наличии следующих результатов в контролях:

    -в контроле культуры клеток не должно быть изменений монослоя клеток; -в контроле дозы вируса цитопатическое действие должно быть в рабочем разведении вируса и в разведениях 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 ( в последнем разведении не менее двух пробирок); -в контроле токсичности сывороток в случае положительной сыворотки (переболевшее животное) отсутствует цитопатический эффект, начиная с разведения сыворотки 1:2,при отрицательной сыворотке(отсутствуют специфические антитела) должен быть ципопатический эффект, как и в культурах с контролем дозы вируса(рабочее разведение); -в контроле специфически вируса отсутствует цитопатический эффект в культурах, инокулированных смесью специфической сыворотки и вируса.

Наличие специфических антител в испытуемых сыворотках крови свидетельствует об инфицировании данной особи, группы животных возбудителем болезни Ауески или возможной вакцинации животных против болезни Ауески. Положительный результат серологического метода исследования сывороток крови невакцинированных животных свидетельствует о подозрении на заболевание, которое подтверждают постановкой биологической пробы.[4,7]

Для обнаружения и титрования антитела, кроме РН, используется РДП. Сущность реакции заключается в том, что специфические антиген и антитело, помещенные на определенном расстоянии друг от друга в агаровом геле, диффундируют в среду и в местах их встречи образуют полосы преципитации, хорошо видимые при нижнем боковом освещении на темном фоне. В РДП участвуют два компонента - антиген и сыворотка(антитело),проходит реакция в агаровом геле в присутствии в качестве электролита физиологического раствора хлористого натра. Ставят реакцию в чашках Петри или на предметных стенках в микромодификации. При постановки реакции в чашках Петри отбирают чистые, хорошо мытые чашки с ровным дном. В чашку вносят расплавленный в кипящей бане 1%-ный агаровый гель в количестве 25-30 мл с таким расчетом, чтобы слой был 3-4 мм. После застывания агара в нем делают лунки, форма, количество и расположение которых в агаре может быть различное в зависимости от объема и цели исследования. В приготовленные лунки вносят антигены и сыворотки, каждый компанент соответственно в свою лунку по 3-4 капли. После заполнения лунок чашку ставят в термостат при 37?С и, чтобы не было высыхания агара, в чашку кладут кусочек ваты, смоченной водой. Учет реакции проводят через 24-48 и 72 часа. Для этого чашки вынимают из термостата и просматривают на темном фоне при нижнем боковом освещении с помощью осветителя к микроскопу. В положительном случае между лунками со специфическими компанентами появляется за счет образования преципитата серо-белая полоса преципитации. С целью усиления видимости полос, иногда проводят обработку агара с прошедшей реакцией 0,065%-ным раствором серно-кислого кадмия.

РИФ дает возможность видеть при малом увеличении широкие полоски флуоресцирующих нейронов коры головного мозга с отдельными флуоресцирующими клетками. На препараты-отпечатки из патологического материала наносят сыворотку крови, содержащую специфические антитела к данному вирусу и обработанную флуорохромом (веществом, способным светиться при облучении). Если вирусный антиген и меченая сыворотка, содержащая специфические к данному вирусу антитела, соответствуют друг другу, то происходит образование комплекса "антиген + антитело", которое можно обнаружить с помощью люминесцентного микроскопа по специфическому свечению. [3]

В РНГА при использовании эритроцитарного иммуноглобулинового диагностикума обнаруживают вирусный антиген. ИФА прямым иммунопероксидазным методом обнаруживает антиген вируса болезни Ауески в мазках-отпечатках из мозга и слизистой оболочки гортани.[1]

Похожие статьи




Лабораторная диагностика - Диагностика и лечение болезни Ауески у поросят

Предыдущая | Следующая