Анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3 методом ПЦР-ПДРФ - Изучение биоразнообразия популяции крупного рогатого скота

Амплификация фрагмента гена BoLA-DRB3 методом ПЦР

Для последующего анализа методом гнездовой ПЦР амплифицировали участок экзона два гена BoLA-DRB3 размером 284 п. н. (281 п. н. для аллелей с делецей).

Конечный объем реакционной смеси составлял 27 мкл. Количество реакционной смеси определялось с учетом положительного и отрицательного контроля.

Для контроля прохождения реакции проводили электрофорез в 1,5 процентном агарозном геле для оценки качества и концентрации полученного фрагмента.

На гель наносили 5 мкл образца.

Рестрикционный анализ

Для рестрикционного анализа фрагмента экзона 2 гена BoLA-DRB3 использовали эндонуклеазы рестрикции RsaI, HaeIII, BstYI, BstX2I фирмы НПО "СибЭнзим", Россия.

Состав буфера для хранения данных ферментов НПО ("СибЭнзим"): 10мM Tris-HCl (pH 7.4); 300мM хлорид натрия (NaCl); 0,1мM EDTA; 1мM DTT; 0,5мг/мл BSA; 50% глицерин.

Состав буфера для инкубации НПО ("СибЭнзим"): 10 мM Tris-HCl (pH 7,9 при 37 градусах Цельсия); 10мM хлорид магния (MgCl2); 50мM хлорид натрия (NaCl); 1мM DTT.

Для обработки брали 5 мкл продуктов ПЦР. Количество фермента на 1 реакцию - 5 ед. активности. Инкубацию проводили в течение 3 ч.

Рестрикционные фрагменты разделяли с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле. На гель наносили весь объем рестрикционной смеси. Для оценки длины фрагментов использовали маркер молекулярных весов GenPak DNA Marker M50 ООО "Изоген".

Похожие статьи




Анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3 методом ПЦР-ПДРФ - Изучение биоразнообразия популяции крупного рогатого скота

Предыдущая | Следующая